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利用液體活檢揭示cfDNA甲基化實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)分型與動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)新突破
來(lái)自美國(guó)得克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的John V. Heymach與Lauren A. Byers等團(tuán)隊(duì)合作，通過(guò)納入179名小細(xì)胞肺癌（SCLC）患者的兩個(gè)獨(dú)立臨床隊(duì)列，采用前瞻性設(shè)計(jì)的FFPE-RBS和cfDNA-RBS技術(shù)，系統(tǒng)繪制了SCLC轉(zhuǎn)錄亞型的DNA甲基化圖譜，成功開(kāi)發(fā)了一種高度準(zhǔn)確的DNA甲基化分類(lèi)器（SCLC-DMC），實(shí)現(xiàn)了從腫瘤組織和血漿樣本中同時(shí)鑒定四種SCLC亞型（SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P和SCLC-I）。相關(guān)研究成果以“Tumor- and circulating-free DNA methylation identifies clinically relevant small cell lung cancer subtypes“為題發(fā)表于《Cancer Cell》期刊。
該研究作為一項(xiàng)小細(xì)胞肺癌（SCLC）分子分型的突破性成果，首次利用縱向液體活檢證實(shí)，SCLC腫瘤表型在疾病進(jìn)展和治療過(guò)程中存在動(dòng)態(tài)變化，尤其是鑒定出SCLC-A向炎癥型SCLC-I亞型轉(zhuǎn)換，揭示了cfDNA甲基化在臨床治療全周期持續(xù)監(jiān)測(cè)SCLC分子亞型的重要價(jià)值。該研究以cfDNA甲基化建立SCLC精準(zhǔn)分型的新型生物標(biāo)志物體系，為克服傳統(tǒng)組織活檢樣本稀缺、片段降解等技術(shù)瓶頸提供了創(chuàng)新解決方案，推動(dòng)了SCLC個(gè)性化治療的臨床應(yīng)用前景。
英文標(biāo)題：Tumor- and circulating-free DNA methylation identifies clinically relevant small cell lung cancer subtypes
中文標(biāo)題：ctDNA和cfDNA DNA甲基化可鑒定臨床相關(guān)的小細(xì)胞肺癌亞型
發(fā)表時(shí)間：2024年
發(fā)表期刊：Cancer Cell
影響因子：IF44.5/Q1
技術(shù)平臺(tái)：RNA-seq、FFPE-RBS、cfDNA-RBS
作者單位：MD安德森癌癥中心
DOI:10.1016/j.ccell.2024.01.001
小細(xì)胞肺癌（SCLC）是一種存在不同轉(zhuǎn)錄亞型的侵襲性惡性腫瘤，但由于SCLC組織樣本的稀缺性，其在臨床中精準(zhǔn)分型仍面臨挑戰(zhàn)。此前研究結(jié)果表明，SCLC關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄程序主要受表觀遺傳調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)在SCLC患者的腫瘤組織或血液樣本中可檢測(cè)到不同亞型的特異性DNA甲基化模式。具體而言，通過(guò)對(duì)179名SCLC患者的兩個(gè)隊(duì)列進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序分析（FFPE-RBS和cfDNA-RBS），并采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法開(kāi)發(fā)出DNA甲基化分類(lèi)器（SCLC-DMC），能夠準(zhǔn)確區(qū)分SCLC亞型。
研究進(jìn)一步研究利用該分類(lèi)器對(duì)血漿cfDNA以進(jìn)行SCLC亞型分型，發(fā)現(xiàn)SCLC表型在疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)生變化，表明在臨床治療方案中對(duì)SCLC進(jìn)行縱向追蹤的必要性。這些數(shù)據(jù)充分證實(shí)，腫瘤和cfDNA甲基化可用于鑒定SCLC亞型，并可能指導(dǎo)SCLC的精準(zhǔn)治療。
研究亮點(diǎn)
- 小細(xì)胞肺癌亞型可通過(guò)RNA-seq測(cè)序和預(yù)測(cè)模型進(jìn)行評(píng)估
- cfDNA-RBS小細(xì)胞肺癌亞型具有亞型特異性DNA甲基化譜
- DNA甲基化可以從組織活檢和液體活檢中進(jìn)行亞型分型
- 液體活檢為患者亞型診斷提供了一種無(wú)創(chuàng)替代方案
圖形摘要
研究方法
隊(duì)列及樣本：
研究納入兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列共179名SCLC患者，收集其FFPE腫瘤組織和匹配的血漿樣本。
分子機(jī)制分析：
- RNA測(cè)序（RNA-seq）：對(duì)142個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行RNA-seq，使用SCLC-GRC基因比率分類(lèi)器作為“金標(biāo)準(zhǔn)”定義SCLC的四種亞型（SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P和SCLC-I）。
- 簡(jiǎn)化基因組甲基化測(cè)序（cfDNA-RBS和FFPE-RBS）：對(duì)124個(gè)FFPE腫瘤組織樣本和54個(gè)血漿cfDNA樣本進(jìn)行DNA甲基化分析。
- 超低深度全基因組測(cè)序（ULP-WGS）：評(píng)估血漿樣本中的ctDNA分?jǐn)?shù)。
機(jī)器學(xué)習(xí)與模型構(gòu)建：
- DNA甲基化分類(lèi)器開(kāi)發(fā)：整合腫瘤組織和細(xì)胞系的RRBS數(shù)據(jù)。通過(guò)受試者工作特征曲線（ROC）分析，篩選出與每個(gè)SCLC亞型高度相關(guān)（AUC>0.8）的差異化甲基化位點(diǎn)。
- 模型構(gòu)建：使用極限梯度提升（XGBoost）機(jī)器學(xué)習(xí)算法，訓(xùn)練了500個(gè)模型，并通過(guò)共識(shí)策略（≥50%模型一致）對(duì)樣本進(jìn)行亞型分類(lèi)，由此構(gòu)建了SCLC-DMC（組織）和cfDMC（血漿）。
數(shù)據(jù)分析：
比較不同亞型間的全基因組甲基化模式、差異表達(dá)基因（表觀遺傳調(diào)控酶），并分析亞型與藥物敏感性（體外細(xì)胞系數(shù)據(jù)）及患者總生存期（OS）的相關(guān)性。
結(jié)果圖形
（1）血漿DNA甲基化檢測(cè)SCLC
研究首先驗(yàn)證了cfDNA甲基化檢測(cè)在SCLC早篩早診中的可行性。他們使用了一個(gè)包含6個(gè)肺癌特異性甲基化標(biāo)記物的PCR商業(yè)檢測(cè)方法對(duì)52例SCLC患者和398例對(duì)照的血漿cfDNA甲基化進(jìn)行分析。
結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法區(qū)分SCLC患者與對(duì)照的曲線下面積（AUC）高達(dá)0.988，具有極高的靈敏度和特異性（圖1A）。這表明基于cfDNA甲基化的檢測(cè)方法能夠高精度地識(shí)別SCLC存在，為后續(xù)基于cfDNA進(jìn)行亞型分型奠定了基礎(chǔ)。
圖1：SCLC的檢測(cè)與分類(lèi)
（2）臨床標(biāo)本隊(duì)列的RNA-seq與DNA甲基化分析隊(duì)列
研究建立了兩個(gè)獨(dú)立的患者隊(duì)列（C1和C2），共179名SCLC患者，旨在同步獲取RNA表達(dá)譜和DNA甲基化譜數(shù)據(jù)。排除RNA或DNA質(zhì)量或數(shù)量不足的樣本后，研究最終對(duì)142個(gè)樣本進(jìn)行了RNA-seq，對(duì)124個(gè)組織樣本進(jìn)行了RRBS甲基化分析，并對(duì)54個(gè)血漿樣本進(jìn)行了cfDNA-RBS分析（表1）。這個(gè)精心設(shè)計(jì)的、配對(duì)的多組學(xué)隊(duì)列是后續(xù)開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證甲基化分類(lèi)器的關(guān)鍵資源。
在15/74份樣本（21%）無(wú)法進(jìn)行RRBS。排除這些樣本后，C2的RRBS成功率為72%（41/57），整個(gè)數(shù)據(jù)集的成功率為76%（124/164）。
(3) 基于簡(jiǎn)化機(jī)器學(xué)習(xí)RNA-seq特征對(duì)臨床SCLC進(jìn)行分類(lèi)
為建立一個(gè)適用于單個(gè)樣本且更實(shí)用的分型工具，研究者在之前非負(fù)矩陣分解（NMF）分型的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了一個(gè)基于181個(gè)基因比率的分類(lèi)器（SCLC-GRC）。該分類(lèi)器通過(guò)整合500個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)模型的共識(shí)，能夠以96%的成功率（136/142）將樣本明確分為四種亞型，其亞型分布與大型臨床試驗(yàn)（IMpower133）中的比例相似（圖1B）。該GRC分類(lèi)器被用作后續(xù)DNA甲基化分類(lèi)器性能評(píng)估的基準(zhǔn)。
（4）SCLC-P的全基因組低甲基化特征
通過(guò)分析全基因組DNA甲基化模式，研究者發(fā)現(xiàn)不同SCLC亞型具有特異性甲基化圖譜。最顯著的表觀遺傳差異是，SCLC-P亞型在腫瘤組織中表現(xiàn)出全基因組范圍的低甲基化（hypomethylation），而SCLC-N則呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，SCLC-A和SCLC-I介于兩者之間（圖2A）。有趣的是，這種模式在SCLC細(xì)胞系中發(fā)生了逆轉(zhuǎn)（SCLC-P細(xì)胞系反而高甲基化），提示腫瘤微環(huán)境可能影響全局甲基化狀態(tài)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與DNA和組蛋白甲基化酶（如DNMT1/3A/3B, MAT2A, SUV39H1）在不同亞型之間存在差異表達(dá)（圖2B-F），特別是SUV39H1-DNMT3A/B軸可能參與不同亞型甲基化差異調(diào)控（圖2G）。通過(guò)ROC分析，研究者鑒定出大量與不同亞型特異性相關(guān)（AUC > 0.8）的100 bp基因組區(qū)域（圖2H-L），這些區(qū)域?yàn)闃?gòu)建甲基化分類(lèi)器提供了候選標(biāo)志物。
圖2：小細(xì)胞肺癌中亞型特異性的DNA甲基化
RRBS進(jìn)行DNA甲基化分析，并在C1腫瘤樣本中以100kbp為窗口對(duì)每個(gè)樣本和亞型的DNA甲基化進(jìn)行平均，突出顯示500 bins（=50mbp）的滾動(dòng)平均值。
(B-G) 對(duì)每個(gè)SCLC亞型的基因表達(dá)進(jìn)行分析，包括DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1；B）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A；C）和3B（DNMT3B；D）、甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A（MAT2A；E）以及組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SUV39H1；F）。（G）SUV39H1表達(dá)與組蛋白甲基化關(guān)聯(lián)的機(jī)制。
(H) 示意圖突出顯示使用100bp窗口與每個(gè)SCLC亞型相關(guān)的DNA甲基化位點(diǎn)的分析和篩選過(guò)程。
(I–L) 展示了SCLC-A（I）、SCLC-N（J）、SCLC-P（K）和SCLC-I（L）在各染色體上的DNA甲基化窗口及其在基因組中的位置，并注明了每個(gè)亞型的區(qū)域數(shù)量。
（5）DNA甲基化可用于SCLC標(biāo)本分類(lèi)
基于上述發(fā)現(xiàn)的亞型特異性甲基化差異，研究者開(kāi)發(fā)了SCLC-DNA甲基化分類(lèi)器（SCLC-DMC），將數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練集和測(cè)試集，篩選出與各亞型高度相關(guān)的甲基化位點(diǎn)并構(gòu)建模型。在獨(dú)立測(cè)試集上，SCLC-DMC的分類(lèi)準(zhǔn)確率達(dá)到95.8%，與RNA-based的GRC分類(lèi)器高度一致（圖3B）。更重要的是，SCLC-DMC成功對(duì)30個(gè)丟失RNA-seq數(shù)據(jù)的樣本進(jìn)行準(zhǔn)確分型，證明了其在RNA分析失敗情況下的應(yīng)用價(jià)值。該分類(lèi)器在SCLC細(xì)胞系中也表現(xiàn)出高準(zhǔn)確度（96.6%）。
圖3：基于DNA甲基化的SCLC亞型
（6）DNA甲基化在ctDNA中得以保留，并可用于SCLC亞型分類(lèi)
研究團(tuán)隊(duì)首先利用ULP-WGS和7個(gè)線性相關(guān)CpG位點(diǎn)的甲基化水平（R=0.89, p<0.0001），建立了cfDNA中ctDNA比例的便捷評(píng)估方法（圖3C），發(fā)現(xiàn)基線樣本與進(jìn)展期樣本ctDNA負(fù)荷無(wú)顯著差異（圖3D），證實(shí)疾病全程均可實(shí)施液體活檢。比較配對(duì)腫瘤組織與血漿甲基化圖譜顯示，SCLC特異性甲基化模式在cfDNA中得以保留（圖3E）。基于此，研究團(tuán)隊(duì)使用與組織SCLC-DMC相同的甲基化位點(diǎn)（經(jīng)cfDNA檢測(cè)靈敏度過(guò)濾），專(zhuān)門(mén)為cfDNA數(shù)據(jù)調(diào)整并訓(xùn)練了新的cfDMC分類(lèi)器，該cfDMC在血漿樣本中實(shí)現(xiàn)了與組織GRC分型100%一致（43/43）（圖3F），與組織DMC分型93.3%一致。更具臨床價(jià)值的是，對(duì)匹配的基線-進(jìn)展期血漿樣本的縱向分析揭示，部分（13例）SCLC-A患者在治療后出現(xiàn)向SCLC-I的亞型轉(zhuǎn)換（圖3G），其免疫相關(guān)基因（CXCL12、CIITA、STAT1及干擾素受體）啟動(dòng)子甲基化顯著降低，伴隨炎癥表型覺(jué)醒。這種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)能力是傳統(tǒng)組織活檢無(wú)法實(shí)現(xiàn)的，cfDNA-RBS的微創(chuàng)特性使重復(fù)采樣成為可能，為捕捉治療誘導(dǎo)的腫瘤演化提供了可行途徑。
（7）DNA甲基化預(yù)測(cè)藥物反應(yīng)和臨床結(jié)局的能力與基因表達(dá)相似
為驗(yàn)證甲基化分型的生物學(xué)和臨床相關(guān)性，研究者進(jìn)行了兩方面分析。
首先，在SCLC細(xì)胞系中，基于甲基化分型（SCLC-DMC）定義的亞型，能夠復(fù)現(xiàn)出基于基因表達(dá)分型已知的藥物敏感性差異。例如，SCLC-N細(xì)胞系對(duì)CDK抑制劑R-547和Aurora激酶抑制劑CYC-116更敏感（圖4A-B）。
其次，在患者隊(duì)列中，基于DNA甲基化（SCLC-DMC）分型得到的SCLC-A和SCLC-N亞型患者，其總生存期（OS）與基于RNA（SCLC-GRC）分型得到的結(jié)果沒(méi)有顯著差異（圖4C-D）。這表明DNA甲基化分類(lèi)器不僅能在技術(shù)上準(zhǔn)確分型，還能反映與基因表達(dá)分型相似的預(yù)后信息，具有臨床實(shí)用性。
圖4：SCLC分型方法對(duì)體外藥物篩選和臨床結(jié)局的作用
結(jié)論和啟示
本研究成功開(kāi)發(fā)了基于組織和cfDNA甲基化的SCLC亞型分類(lèi)器，且揭示了SCLC的特異性DNA甲基化特征存在于腫瘤組織和血液游離細(xì)胞中，可通過(guò)液體活檢進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)微創(chuàng)、準(zhǔn)確的分子分型和疾病進(jìn)展監(jiān)測(cè)。
cfDNA-RBS在本研究中扮演了核心技術(shù)作用，通過(guò)限制性酶切富集基因組中CpG密集區(qū)域（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子），在保證全基因組覆蓋度的同時(shí)，大幅降低了測(cè)序成本和數(shù)據(jù)量，特別適用于cfDNA這種DNA總量少、片段化的樣本。利用cfDNA-RBS獲得的甲基化譜，能夠高度還原腫瘤組織的表觀遺傳特征，從而從“液體活檢”中獲取與組織活檢一致的分子分型信息。
參考文獻(xiàn)：
Heeke S, …, Byers LA, Heymach JV,et al. Tumor- and circulating-free DNA methylation identifies clinically relevant small cell lung cancer subtypes. Cancer Cell. 2024 Jan 24. doi: 10.1016/j.ccell.2024.01.001.
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