RNA-seq等多組學技術揭示5mC甲基化抑制基因組DNA高級結構形成
2025年7月11日，華南師范大學�？悼蹈苯淌诤拖蚶姼毖芯繂T為論文共同第一作者，�？悼蹈苯淌诤婉T啟理教授為共同通訊作者，在國際重要學術刊物《Genome Biology》（基因組生物學）上發(fā)表題為 “DNA 5mC methylation inhibits the formation of G-quadruplex structures in the genome” 的最新研究成果。研究通過整合公共數(shù)據(jù)、應用甲基化抑制劑與構建DNMT1基因敲除細胞系，在此基礎上應用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、CUT&Tag、ATAC-seq及RNA-seq等多組學技術，驗證了DNA甲基化直接抑制基因組G-四鏈體結構（G4）的形成。這種抑制作用不依賴于染色質開放狀態(tài)，而是通過抑制G4形成以動態(tài)調控鄰近基因的轉錄活性。該研究為理解DNA甲基化和G4這兩種重要表觀遺傳機制如何協(xié)同調控基因表達提供了全新視角，特別是在細胞發(fā)育和疾�。ㄈ绨┌Y）狀態(tài)下的異常調控。
英文標題：DNA 5mC methylation inhibits the formation of G-quadruplex structures in the genome
中文標題：DNA 5mC甲基化修飾抑制基因組G4結構形成
發(fā)表時間：2025-7-11
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術平臺：WGBS、CUT&Tag、ATAC-seq、RNA-seq等
作者單位：華南師范大學
DOI:10.1186/s13059-025-03678-4
G-四鏈體結構（G-quadruplex，G4）是一種非典型DNA高級結構，在細胞中的形成具有組織特異性和動態(tài)變化特征。G4已在多種生物基因組中被證實對基因轉錄具有重要的表觀遺傳調控作用。有趣的是，在細胞條件下，僅有少部分G4形成潛力（Putative Quadruplex Sequences，PQSs）能夠折疊為G4結構。本研究以家蠶和人類細胞為研究對象，探討了DNA甲基化與染色質可及性對G4形成的互作及其對基因表達的作用。
研究發(fā)現(xiàn)，基因組5mC DNA甲基化水平與G4豐度之間存在顯著負相關性。當通過甲基化抑制劑處理或DNMT1敲除降低全基因組甲基化水平時，基因組G4豐度顯著增加。DNMT1敲除細胞中G4信號增加可通過DNMT1過表達逆轉。結合ATAC-seq、WGBS和G4 CUT&Tag分析表明，DNA甲基化在開放和關閉的染色質狀態(tài)下均抑制G4形成。5mC修飾對G4形成的直接抑制作用通過圓二色譜和EMSA實驗在體外得到驗證。G4 CUT&Tag和RNA-seq分析揭示，DNA甲基化降低增強G4形成并促進鄰近基因轉錄。
本研究證明，5mC DNA甲基化直接抑制基因組中G4形成并調控后續(xù)基因轉錄，證實了G4與DNA甲基化互作是基因轉錄表觀遺傳調控的重要機制。
（1）細胞與組織模型
化學干預模型：使用DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dC（核苷類似物）和RG108（非核苷類）處理人胚腎293T細胞（CRL-3216）和肝腺癌SK-Hep-1細胞（HTB-52），誘導全基因組低甲基化狀態(tài)。隨后PDS處理細胞48小時，以穩(wěn)定已形成的G4結構。
臨床樣本模型：收集患者癌變與非癌變的直腸組織，通過免疫熒光比較整體甲基化水平與G4豐度。
（2）基因編輯：
DNMT1敲除構建pX459-gRNA重組質粒并轉染293T細胞，最終鑒定出兩種純合突變體：DNMT1-KO-1和DNMT1-KO-2。通過基因組DNA測序、qRT-PCR和Western blot驗證敲除效率。
（3）多組學測序技術
WGBS：對293T野生型（WT）和DNMT1-KO-2細胞進行WGBS，以單堿基分辨率繪制全基因組DNA甲基化圖譜。
G4 CUT&Tag：使用G4特異性抗體BG4，在293T WT和DNMT1-KO-2細胞中進行CUT&Tag實驗，高通量、高信噪比繪制基因組內原位G4結構的分布圖譜。
ATAC-seq：在同一對細胞系中進行ATAC-seq以評估染色質可及性變化，用于區(qū)分甲基化對G4的直接作用和通過染色質狀態(tài)產生的間接作用。
RNA-seq：對WT和DNMT1-KO-2細胞進行轉錄組測序，鑒定差異表達基因（DEGs），并將表達變化與G4形成及甲基化變化進行關聯(lián)分析。
（4）體外生化實驗驗證
圓二色譜（CD）：合成特定基因（hPDGFR-β, hVEGF, 家蠶BmPOUM2）啟動子區(qū)PQS的甲基化和非甲基化寡核苷酸，通過CD光譜檢測其特征峰（~265 nm）變化，驗證甲基化對G4折疊的直接作用。
電泳遷移率變動分析（EMSA）：觀察甲基化對G4結構形成的作用。同時利用已知的G4結合蛋白（LARK）和抗體（BG4），通過EMSA進一步證明甲基化會抑制G4與蛋白的特異性結合。
結果圖形
（1）G4形成與DNA 5mC甲基化呈負相關
本研究首先通過整合NCBI數(shù)據(jù)庫的人宮頸癌HeLa和慢性髓性白血病K562細胞系的WGBS及G4 CUT&Tag數(shù)據(jù)，揭示了G4形成與DNA甲基化在全基因組范圍內的負相關。
研究團隊以轉錄起始位點（TSS）為中心，分析其±1 kb區(qū)域內甲基化水平與G4信號的相關性。通過將基因按啟動子區(qū)甲基化水平排序，篩選出高甲基化組10,000個基因和低甲基化組10,000個基因。分析發(fā)現(xiàn)，在低甲基化基因的TSS區(qū)域，G4 CUT&Tag信號顯著更強；而在高甲基化基因的相同區(qū)域，G4信號則顯著更弱（圖1a, b, e, f）。為排除本身G4形成潛力序列（PQS豐度）差異的影響，研究進一步比較了兩組基因的PQS密度。結果顯示，雖然低甲基化基因的PQS豐度僅略增加（圖1c, g），但其G4信號密度卻比高甲基化基因高出數(shù)倍（圖1d, h）。表明高甲基化基因區(qū)域G4信號少，并非由PQS序列差異導致，而可能是因為甲基化直接抑制了PQS向G4結構折疊。
在隨機選擇的8個含PQS基因（DBI、ITPR1-DT、ASL、REXO2、KIT、CMPK2、P2RY1、LMO7）中，可視化分析顯示G4富集峰與低甲基化區(qū)域高度重疊，即便在不同細胞系間甲基化模式存在差異，這種負相關關系依然穩(wěn)定存在（圖1i, j）。為在生理病理模型中驗證這一關系，研究者比較了直腸癌組織和癌旁組織，結果顯示癌組織（全基因組低甲基化）的整體甲基化水平顯著低于正常組織（圖1k），而相應的G4豐度則顯著高于正常組織（圖1l, m）。這一系列分析從計算預測、細胞系到臨床樣本，層層遞進，有力證實DNA 5mC甲基化水平與基因組G4結構存在廣泛負相關。
（2）當甲基化被抑制時，G4豐度顯著增加
為驗證上述甲基化與G4之間負相關的因果性，研究團隊采用多種實驗手段降低基因組甲基化水平并觀察G4豐度變化。首先，使用甲基化抑制劑5-aza-dC或RG108處理293T和SK-Hep-1細胞，免疫熒光結果顯示，兩種藥物均顯著降低全基因組5mC信號（圖2a-d），同時伴隨著BG4檢測的G4信號顯著增強（圖2e-h）。
其次，為獲得更好甲基化抑制模型，研究者在293T細胞中通過CRISPR/Cas9敲除DNMT1基因，獲得兩個純合突變細胞系（DNMT1-KO-1和DNMT1-KO-2）。與野生型（WT）細胞系相比，KO細胞系中DNMT1的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（圖2j, k），全基因組甲基化水平也顯著降低，尤其在KO-2克隆中更為明顯（圖2l, m）。而兩個敲除細胞系中的G4豐度均顯著上升，且甲基化降低更明顯的KO-2細胞系中G4表現(xiàn)出更顯著增加（圖2l-o）。
功能挽救實驗進一步證實了因果聯(lián)系：在DNMT1-KO-2細胞中外源過表達帶His標簽的DNMT1蛋白后（圖2p），挽救后全基因組甲基化水平得以恢復（圖2q），伴隨G4信號顯著回落（圖2r, s）。這一系列“降低-升高-再降低-再升高”的可逆實驗，證明了DNA甲基化水平對G4結構的形成具有直接的抑制作用：甲基化水平降低促進G4形成，而甲基化水平升高則抑制G4形成。
圖2：甲基化水平降低對G4形成的作用。
（3）基因組低甲基化增強G4形成，不完全依賴于染色質可及性變化
染色質開放狀態(tài)被認為是G4形成的重要前提，為此，研究人員深入探討了甲基化調控是否通過改變染色質可及性間接作用于G4。研究在293T野生型與DNMT1-KO-2細胞中平行進行G4 CUT&Tag、ATAC-seq和WGBS分析。分析結果顯示，DNMT1敲除細胞的整體G4信號更強（圖3d），且共有G4峰強度也更高（圖3e）。通過分析56,415個同時含G4峰和CpG的PQS位點，發(fā)現(xiàn)G4信號與染色質可及性（ATAC信號）呈弱正相關，與甲基化水平呈負相關（圖3f）。
接下來，研究者根據(jù)染色質狀態(tài)（開放/閉合）和甲基化水平（高/低）對PQS進行分類（圖3g）。分析表明，無論在開放/閉合的染色質區(qū)域，低甲基化PQS的G4信號均顯著高于高甲基化PQS（圖3h-j）。為進一步控制變量，研究者從兩組細胞中篩選出染色質可及性無差異的基因組區(qū)域（圖3l, m）。在染色質狀態(tài)相同區(qū)域中，DNMT1-KO-2細胞的甲基化水平顯著低于WT細胞，而其G4信號顯著高于WT細胞（圖3n-o）。這些數(shù)據(jù)共同表明，DNA甲基化對G4形成的抑制作用并不完全依賴于其染色質狀態(tài)改變，即甲基化可以直接抑制G4的折疊，無論該區(qū)域染色質是否開放。
圖3：甲基化和染色質可及性對G4形成的功能作用。
（4）基因組低甲基化通過增加G4形成以增強基因轉錄
G4在基因啟動子區(qū)富集并通常與活躍轉錄相關，而DNA甲基化通常抑制轉錄。研究人員通過比較WT和DNMT1-KO-2細胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DNMT1敲除導致2645個基因上調和1002個基因下調（圖4a）。值得注意的是，在上調基因的啟動子區(qū)域（TSS ±1kb），G4 CUT&Tag信號在KO細胞中顯著增強（圖4b），表明轉錄激活與G4增加高度耦合。例如，MTARC1、DBI和ASL等基因在KO細胞中不僅啟動子區(qū)G4信號更強，其轉錄本豐度也更高（圖4c）。這表明由DNMT1敲除引起的全基因組低甲基化，通過促進啟動子區(qū)域的G4結構形成，進而上調這些基因的轉錄水平。
（5）5mC DNA甲基化直接抑制PQS折疊成G4
為在最直接的分子水平上證實甲基化的抑制作用，研究選取了三個已被充分研究的、來自不同基因（hPDGFR-β、hVEGF、家蠶BmPOUM2）啟動子區(qū)域PQS序列（圖5a）。通過BSP或公共WGBS數(shù)據(jù)確定這些序列中特定CpG位點的甲基化狀態(tài)：hPDGFR-β G4的 loop區(qū)有2個5mC位點，hVEGF G4的 loop區(qū)有3個，BmPOUM2 G4的5'端、 loop區(qū)和3'端共有3個。
合成這些序列含或不含5mC修飾的寡核苷酸后進行體外實驗。圓二色譜（CD）分析顯示，所有三個序列的甲基化在265 nm處的G4特征峰強度均低于非甲基化對照（圖5b-d），表明甲基化抑制了G4結構的形成。電泳遷移率變動分析（EMSA）進一步證實，在鉀離子（K+）存在下，非甲基化PQS能形成遷移速率更慢的G4結構條帶；而一旦序列中的CpG被甲基化，該G4條帶的強度就大幅減弱甚至消失（圖5e-j）。此外，EMSA還證明，甲基化后的PQS與G4特異性結合蛋白LARK以及G4抗體BG4的結合能力也顯著下降（圖5i, j）。體外生化實驗排除所有細胞內部復雜因素干擾，直接證明5mC修飾本身能夠直接干擾PQS折疊成穩(wěn)定的G4結構，并阻礙其與功能蛋白互作。
結論和啟示
本研究通過WGBS+CUT&Tag+ATAC-seq+RNA-seq等多組學綜合分析，揭示了DNA 5mC甲基化是基因組G4結構形成的關鍵抑制性表觀遺傳標記，且不依賴于染色質可及性變化，而是通過直接作用于DNA序列，抑制PQS折疊為G4結構，進而調控基因轉錄活性。在DNMT1缺失或抑制的條件下，全基因組低甲基化導致G4異常增加，進而引發(fā)腫瘤等疾病中的基因表達失調。
總之，本研究深化了對G4動態(tài)形成機制的理解，闡明了DNA甲基化與G4這兩種表觀遺傳因素在轉錄調控中的相互作用，對于認識正常發(fā)育和疾�。ㄈ绨┌Y）發(fā)生具有重要啟示。
本研究中的WGBS技術提供了無可替代的、單堿基分辨率全基因組甲基化數(shù)據(jù)，是連接遺傳干預（DNMT1-KO）、表型觀察（G4變化）和功能出核（轉錄變化）的關鍵方法。對于未來類似研究（如探索其他DNA修飾與結構的關系、染色質狀態(tài)互作等）具有重要意義。
參考文獻：
Niu K, Xiang L, Zhang X, Li X, Yao T, Li J, Zhang C, Liu J, Peng Y, Xu G, Xiang H, Wang H, Song Q, Feng Q. DNA 5mC methylation inhibits the formation of G-quadruplex structures in the genome. Genome Biol. 2025 Jul 11;26(1):202. doi: 10.1186/s13059-025-03678-4.
英文標題：DNA 5mC methylation inhibits the formation of G-quadruplex structures in the genome
中文標題：DNA 5mC甲基化修飾抑制基因組G4結構形成
發(fā)表時間：2025-7-11
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術平臺：WGBS、CUT&Tag、ATAC-seq、RNA-seq等
作者單位：華南師范大學
DOI:10.1186/s13059-025-03678-4
G-四鏈體結構（G-quadruplex，G4）是一種非典型DNA高級結構，在細胞中的形成具有組織特異性和動態(tài)變化特征。G4已在多種生物基因組中被證實對基因轉錄具有重要的表觀遺傳調控作用。有趣的是，在細胞條件下，僅有少部分G4形成潛力（Putative Quadruplex Sequences，PQSs）能夠折疊為G4結構。本研究以家蠶和人類細胞為研究對象，探討了DNA甲基化與染色質可及性對G4形成的互作及其對基因表達的作用。
研究發(fā)現(xiàn)，基因組5mC DNA甲基化水平與G4豐度之間存在顯著負相關性。當通過甲基化抑制劑處理或DNMT1敲除降低全基因組甲基化水平時，基因組G4豐度顯著增加。DNMT1敲除細胞中G4信號增加可通過DNMT1過表達逆轉。結合ATAC-seq、WGBS和G4 CUT&Tag分析表明，DNA甲基化在開放和關閉的染色質狀態(tài)下均抑制G4形成。5mC修飾對G4形成的直接抑制作用通過圓二色譜和EMSA實驗在體外得到驗證。G4 CUT&Tag和RNA-seq分析揭示，DNA甲基化降低增強G4形成并促進鄰近基因轉錄。
本研究證明，5mC DNA甲基化直接抑制基因組中G4形成并調控后續(xù)基因轉錄，證實了G4與DNA甲基化互作是基因轉錄表觀遺傳調控的重要機制。
圖形摘要：G4s和5mC甲基化的基因轉錄調控機制示意圖
- 正常條件下，整體基因轉錄處于平衡狀態(tài)。含有非甲基化的PQSs基因由于G4s形成而活躍轉錄，而含有甲基化PQSs的基因轉錄被抑制 (a)。
- 在某些情況下（如癌癥），全基因組處于低甲基化狀態(tài)，形成更多G4s，導致轉錄水平升高，尤其是癌基因轉錄 (b)。
- 當細胞基因組處于高甲基化狀態(tài)時，G4形成受到抑制，整體基因轉錄被抑制 (c)。
（1）細胞與組織模型
化學干預模型：使用DNA甲基轉移酶抑制劑5-Aza-dC（核苷類似物）和RG108（非核苷類）處理人胚腎293T細胞（CRL-3216）和肝腺癌SK-Hep-1細胞（HTB-52），誘導全基因組低甲基化狀態(tài)。隨后PDS處理細胞48小時，以穩(wěn)定已形成的G4結構。
臨床樣本模型：收集患者癌變與非癌變的直腸組織，通過免疫熒光比較整體甲基化水平與G4豐度。
（2）基因編輯：
DNMT1敲除構建pX459-gRNA重組質粒并轉染293T細胞，最終鑒定出兩種純合突變體：DNMT1-KO-1和DNMT1-KO-2。通過基因組DNA測序、qRT-PCR和Western blot驗證敲除效率。
（3）多組學測序技術
WGBS：對293T野生型（WT）和DNMT1-KO-2細胞進行WGBS，以單堿基分辨率繪制全基因組DNA甲基化圖譜。
G4 CUT&Tag：使用G4特異性抗體BG4，在293T WT和DNMT1-KO-2細胞中進行CUT&Tag實驗，高通量、高信噪比繪制基因組內原位G4結構的分布圖譜。
ATAC-seq：在同一對細胞系中進行ATAC-seq以評估染色質可及性變化，用于區(qū)分甲基化對G4的直接作用和通過染色質狀態(tài)產生的間接作用。
RNA-seq：對WT和DNMT1-KO-2細胞進行轉錄組測序，鑒定差異表達基因（DEGs），并將表達變化與G4形成及甲基化變化進行關聯(lián)分析。
（4）體外生化實驗驗證
圓二色譜（CD）：合成特定基因（hPDGFR-β, hVEGF, 家蠶BmPOUM2）啟動子區(qū)PQS的甲基化和非甲基化寡核苷酸，通過CD光譜檢測其特征峰（~265 nm）變化，驗證甲基化對G4折疊的直接作用。
電泳遷移率變動分析（EMSA）：觀察甲基化對G4結構形成的作用。同時利用已知的G4結合蛋白（LARK）和抗體（BG4），通過EMSA進一步證明甲基化會抑制G4與蛋白的特異性結合。
結果圖形
（1）G4形成與DNA 5mC甲基化呈負相關
本研究首先通過整合NCBI數(shù)據(jù)庫的人宮頸癌HeLa和慢性髓性白血病K562細胞系的WGBS及G4 CUT&Tag數(shù)據(jù)，揭示了G4形成與DNA甲基化在全基因組范圍內的負相關。
研究團隊以轉錄起始位點（TSS）為中心，分析其±1 kb區(qū)域內甲基化水平與G4信號的相關性。通過將基因按啟動子區(qū)甲基化水平排序，篩選出高甲基化組10,000個基因和低甲基化組10,000個基因。分析發(fā)現(xiàn)，在低甲基化基因的TSS區(qū)域，G4 CUT&Tag信號顯著更強；而在高甲基化基因的相同區(qū)域，G4信號則顯著更弱（圖1a, b, e, f）。為排除本身G4形成潛力序列（PQS豐度）差異的影響，研究進一步比較了兩組基因的PQS密度。結果顯示，雖然低甲基化基因的PQS豐度僅略增加（圖1c, g），但其G4信號密度卻比高甲基化基因高出數(shù)倍（圖1d, h）。表明高甲基化基因區(qū)域G4信號少，并非由PQS序列差異導致，而可能是因為甲基化直接抑制了PQS向G4結構折疊。
在隨機選擇的8個含PQS基因（DBI、ITPR1-DT、ASL、REXO2、KIT、CMPK2、P2RY1、LMO7）中，可視化分析顯示G4富集峰與低甲基化區(qū)域高度重疊，即便在不同細胞系間甲基化模式存在差異，這種負相關關系依然穩(wěn)定存在（圖1i, j）。為在生理病理模型中驗證這一關系，研究者比較了直腸癌組織和癌旁組織，結果顯示癌組織（全基因組低甲基化）的整體甲基化水平顯著低于正常組織（圖1k），而相應的G4豐度則顯著高于正常組織（圖1l, m）。這一系列分析從計算預測、細胞系到臨床樣本，層層遞進，有力證實DNA 5mC甲基化水平與基因組G4結構存在廣泛負相關。
圖1：人基因TSS周圍區(qū)域DNA甲基化與G4形成比較
（2）當甲基化被抑制時，G4豐度顯著增加
為驗證上述甲基化與G4之間負相關的因果性，研究團隊采用多種實驗手段降低基因組甲基化水平并觀察G4豐度變化。首先，使用甲基化抑制劑5-aza-dC或RG108處理293T和SK-Hep-1細胞，免疫熒光結果顯示，兩種藥物均顯著降低全基因組5mC信號（圖2a-d），同時伴隨著BG4檢測的G4信號顯著增強（圖2e-h）。
其次，為獲得更好甲基化抑制模型，研究者在293T細胞中通過CRISPR/Cas9敲除DNMT1基因，獲得兩個純合突變細胞系（DNMT1-KO-1和DNMT1-KO-2）。與野生型（WT）細胞系相比，KO細胞系中DNMT1的mRNA和蛋白表達水平顯著下降（圖2j, k），全基因組甲基化水平也顯著降低，尤其在KO-2克隆中更為明顯（圖2l, m）。而兩個敲除細胞系中的G4豐度均顯著上升，且甲基化降低更明顯的KO-2細胞系中G4表現(xiàn)出更顯著增加（圖2l-o）。
功能挽救實驗進一步證實了因果聯(lián)系：在DNMT1-KO-2細胞中外源過表達帶His標簽的DNMT1蛋白后（圖2p），挽救后全基因組甲基化水平得以恢復（圖2q），伴隨G4信號顯著回落（圖2r, s）。這一系列“降低-升高-再降低-再升高”的可逆實驗，證明了DNA甲基化水平對G4結構的形成具有直接的抑制作用：甲基化水平降低促進G4形成，而甲基化水平升高則抑制G4形成。
圖2：甲基化水平降低對G4形成的作用。
（3）基因組低甲基化增強G4形成，不完全依賴于染色質可及性變化
染色質開放狀態(tài)被認為是G4形成的重要前提，為此，研究人員深入探討了甲基化調控是否通過改變染色質可及性間接作用于G4。研究在293T野生型與DNMT1-KO-2細胞中平行進行G4 CUT&Tag、ATAC-seq和WGBS分析。分析結果顯示，DNMT1敲除細胞的整體G4信號更強（圖3d），且共有G4峰強度也更高（圖3e）。通過分析56,415個同時含G4峰和CpG的PQS位點，發(fā)現(xiàn)G4信號與染色質可及性（ATAC信號）呈弱正相關，與甲基化水平呈負相關（圖3f）。
接下來，研究者根據(jù)染色質狀態(tài)（開放/閉合）和甲基化水平（高/低）對PQS進行分類（圖3g）。分析表明，無論在開放/閉合的染色質區(qū)域，低甲基化PQS的G4信號均顯著高于高甲基化PQS（圖3h-j）。為進一步控制變量，研究者從兩組細胞中篩選出染色質可及性無差異的基因組區(qū)域（圖3l, m）。在染色質狀態(tài)相同區(qū)域中，DNMT1-KO-2細胞的甲基化水平顯著低于WT細胞，而其G4信號顯著高于WT細胞（圖3n-o）。這些數(shù)據(jù)共同表明，DNA甲基化對G4形成的抑制作用并不完全依賴于其染色質狀態(tài)改變，即甲基化可以直接抑制G4的折疊，無論該區(qū)域染色質是否開放。
圖3：甲基化和染色質可及性對G4形成的功能作用。
（4）基因組低甲基化通過增加G4形成以增強基因轉錄
G4在基因啟動子區(qū)富集并通常與活躍轉錄相關，而DNA甲基化通常抑制轉錄。研究人員通過比較WT和DNMT1-KO-2細胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DNMT1敲除導致2645個基因上調和1002個基因下調（圖4a）。值得注意的是，在上調基因的啟動子區(qū)域（TSS ±1kb），G4 CUT&Tag信號在KO細胞中顯著增強（圖4b），表明轉錄激活與G4增加高度耦合。例如，MTARC1、DBI和ASL等基因在KO細胞中不僅啟動子區(qū)G4信號更強，其轉錄本豐度也更高（圖4c）。這表明由DNMT1敲除引起的全基因組低甲基化，通過促進啟動子區(qū)域的G4結構形成，進而上調這些基因的轉錄水平。
圖4：低甲基化通過增強G4形成以促進基因轉錄
（5）5mC DNA甲基化直接抑制PQS折疊成G4
為在最直接的分子水平上證實甲基化的抑制作用，研究選取了三個已被充分研究的、來自不同基因（hPDGFR-β、hVEGF、家蠶BmPOUM2）啟動子區(qū)域PQS序列（圖5a）。通過BSP或公共WGBS數(shù)據(jù)確定這些序列中特定CpG位點的甲基化狀態(tài)：hPDGFR-β G4的 loop區(qū)有2個5mC位點，hVEGF G4的 loop區(qū)有3個，BmPOUM2 G4的5'端、 loop區(qū)和3'端共有3個。
合成這些序列含或不含5mC修飾的寡核苷酸后進行體外實驗。圓二色譜（CD）分析顯示，所有三個序列的甲基化在265 nm處的G4特征峰強度均低于非甲基化對照（圖5b-d），表明甲基化抑制了G4結構的形成。電泳遷移率變動分析（EMSA）進一步證實，在鉀離子（K+）存在下，非甲基化PQS能形成遷移速率更慢的G4結構條帶；而一旦序列中的CpG被甲基化，該G4條帶的強度就大幅減弱甚至消失（圖5e-j）。此外，EMSA還證明，甲基化后的PQS與G4特異性結合蛋白LARK以及G4抗體BG4的結合能力也顯著下降（圖5i, j）。體外生化實驗排除所有細胞內部復雜因素干擾，直接證明5mC修飾本身能夠直接干擾PQS折疊成穩(wěn)定的G4結構，并阻礙其與功能蛋白互作。
圖5：5mC修飾對G4形成的功能作用
結論和啟示
本研究通過WGBS+CUT&Tag+ATAC-seq+RNA-seq等多組學綜合分析，揭示了DNA 5mC甲基化是基因組G4結構形成的關鍵抑制性表觀遺傳標記，且不依賴于染色質可及性變化，而是通過直接作用于DNA序列，抑制PQS折疊為G4結構，進而調控基因轉錄活性。在DNMT1缺失或抑制的條件下，全基因組低甲基化導致G4異常增加，進而引發(fā)腫瘤等疾病中的基因表達失調。
總之，本研究深化了對G4動態(tài)形成機制的理解，闡明了DNA甲基化與G4這兩種表觀遺傳因素在轉錄調控中的相互作用，對于認識正常發(fā)育和疾�。ㄈ绨┌Y）發(fā)生具有重要啟示。
本研究中的WGBS技術提供了無可替代的、單堿基分辨率全基因組甲基化數(shù)據(jù)，是連接遺傳干預（DNMT1-KO）、表型觀察（G4變化）和功能出核（轉錄變化）的關鍵方法。對于未來類似研究（如探索其他DNA修飾與結構的關系、染色質狀態(tài)互作等）具有重要意義。
參考文獻：
Niu K, Xiang L, Zhang X, Li X, Yao T, Li J, Zhang C, Liu J, Peng Y, Xu G, Xiang H, Wang H, Song Q, Feng Q. DNA 5mC methylation inhibits the formation of G-quadruplex structures in the genome. Genome Biol. 2025 Jul 11;26(1):202. doi: 10.1186/s13059-025-03678-4.
