基于Cytation高通量成像的mRNA-LNP疫苗體外效價(jià)預(yù)測(cè)方法
背景介紹
mRNA 藥物是一種新型的生物技術(shù)藥物，其歷史可以追溯到 20 世紀(jì) 60 年代。最初科學(xué)家們是期望通過(guò) mRNA 分子來(lái)傳遞基因信息，用以治療惡性腫瘤等疾病。伴隨 2019 年 COVID-19 大流行，mRNA 技術(shù)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展，目前已經(jīng)上市的 mRNA 藥物主要是針對(duì) COVID-19 的感染性疾病疫苗，但是在腫瘤治療領(lǐng)域、致敏性疾病、蛋白替代療法等應(yīng)用領(lǐng)域，也有相當(dāng)多的 mRNA 產(chǎn)品進(jìn)入臨床研究階段。
目前，基于 LNP（核酸脂質(zhì)納米顆粒）遞送載體的技術(shù)是 mRNA 藥物的重要平臺(tái)，該平臺(tái)在其他病原體上的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用是極具潛力的，因此需要更加便捷高效的能夠預(yù)測(cè)疫苗有效性的分析方法和工具，從而評(píng)價(jià)候選 mRNA 疫苗的性能，并將它們與預(yù)期的免疫反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)。
呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncytial Virus, RSV) 是一種常見(jiàn)的病毒，主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，引起嬰幼兒呼吸道感染，目前，預(yù)防 RSV 感染的最有效方法是接種疫苗。然而，由于 RSV 的變異性較強(qiáng)，疫苗的研發(fā)和應(yīng)用還面臨一定的挑戰(zhàn)，因此靶向 RSV-F 蛋白的 mRNA 疫苗極具市場(chǎng)前景。2023 年，默沙東分析方法開(kāi)發(fā)部門(mén) (Analytical Research & Development) 在 Vaccines 上發(fā)表了關(guān)于 mRNA-LNP 技術(shù)體外效價(jià)預(yù)測(cè)評(píng)估的方法學(xué)文章，主要介紹了應(yīng)用高通量成像分析法開(kāi)展 RSV（呼吸道合胞病毒）mRNA-LNP 疫苗效力的方法。
研究方案介紹
該方法主要分為三個(gè)部分，包括細(xì)胞株篩選、細(xì)胞培養(yǎng)單層優(yōu)化和方法學(xué)靈敏度測(cè)試，詳細(xì)介紹了基于 96 孔板 RSV-F 蛋白表達(dá)免疫熒光定量分析方案的有效性和靈敏度。
1. 細(xì)胞株篩選
由于 RSV-F 表達(dá)效率在細(xì)胞系之間差異顯著，研究者首先評(píng)價(jià)了包括 HepG2 在內(nèi)的常用的 6 種細(xì)胞系的適用性。不同細(xì)胞細(xì)接種 96 孔板后，貼壁生長(zhǎng)到 90% 匯合度，加入研究用 mRNA-LNP 疫苗轉(zhuǎn)染孵育 16h 后，固定細(xì)胞，免疫熒光染色法處理樣本，隨后放入 Agilent BioTek Cytation3 設(shè)備中對(duì)所有樣本進(jìn)行同樣標(biāo)準(zhǔn)的熒光圖像采集，并通過(guò) Gen5 軟件分析細(xì)胞內(nèi) RSV-F 蛋白的表達(dá)量。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：其中 A549 細(xì)胞未顯示可檢測(cè)到的蛋白表達(dá)，而 Vero、HeLa、HEp-2 和 CaCo-2 中的 RSV-F 表達(dá)表現(xiàn)出明顯的鉤狀效應(yīng)，在最高劑量下仍只能觀察到非常低的 RSV-F 表達(dá)，表明這些細(xì)胞系 ApoE 產(chǎn)生的有限而致使內(nèi)吞能力較低。加入 ApoE 后能夠逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象（圖 A-G）。
HepG2 細(xì)胞提供了完整的 S 形劑量-反應(yīng)曲線，上漸近線收斂在完全細(xì)胞轉(zhuǎn)染（> 90%）上，可實(shí)現(xiàn)廣泛的動(dòng)態(tài)和劑量反應(yīng)范圍，補(bǔ)充 ApoE 會(huì)導(dǎo)致更陡的斜率，并且提高測(cè)定靈敏度，（EC50 下降 20%，圖 1G）。
2. 細(xì)胞單層培養(yǎng)條件優(yōu)化
由于該方案的檢測(cè)方法是高通量成像，需要細(xì)胞樣本以單層培養(yǎng)為佳,但當(dāng) HepG2 匯合度增加時(shí)，細(xì)胞明顯發(fā)生聚集和堆疊（圖 2A）。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)加入模擬體內(nèi)條件的Ⅰ型膠原包被板上進(jìn)行接種，隨著接種密度的降低明顯看到細(xì)胞單層覆蓋，細(xì)胞密度為 3.0×104 時(shí)提供了最穩(wěn)健的結(jié)果（圖 2D），在該密度下，轉(zhuǎn)染 16h 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率> 95%，EC50值 14.0，表明檢測(cè)靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍均大幅提高，最終確定轉(zhuǎn)染 16h 作為最佳效價(jià)測(cè)定時(shí)間（圖 2G）。
3. 方法學(xué)靈敏度測(cè)試
抗原 mRNA 易受多種降解反應(yīng)的影響，包括水解和氧化，以及通過(guò)脂質(zhì)加合物形成的化學(xué)修飾，而評(píng)價(jià)不同降解程度的 mRNA 在效力上的損失方法很困難，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)制備了一組不同 N/P 比的樣品(其中，N 指代脂質(zhì)的胺基團(tuán)，P 指代mRNA上的磷酸鹽，D)，來(lái)模擬疫苗的降解，用于評(píng)價(jià)該方法學(xué)對(duì)不同 mRNA 劑量的靈敏度。
研究發(fā)現(xiàn)，而當(dāng) mRNA 量大于 10ng 時(shí)，由于內(nèi)吞作用飽和、mRNA 量受限，細(xì)胞表達(dá) RSV-F 的能力開(kāi)始與 N/P 值呈反比，說(shuō)明該方法對(duì)于 mRNA 表達(dá)是靈敏度良好 (圖 3AB) 并且可以用于監(jiān)測(cè) mRNA 的實(shí)時(shí)降解情況（圖 C）。
此外，PEG 是 LNP 重要組成部分，PEG 層的比例不同，會(huì)影響 LNP 的攝取。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)而評(píng)估了該方法學(xué)對(duì)不同 PEG 濃度和不同 LNP 粒徑的樣本的檢測(cè)靈敏度。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，較大與較小粒徑都會(huì)降低 mRNA-LNP 蛋白表達(dá)，因此應(yīng)首選中間粒徑（100nm±30nm，圖 4B）以保證內(nèi)吞作用更快發(fā)生，而不同 PEG 占比也具有敏感性，將 PEG 含量提高到 1.5% 以上時(shí)，效力下降（圖 4C）。
研究結(jié)論
該 mRNA-LNP 疫苗效價(jià)測(cè)定方法對(duì) LNP 生物學(xué)性質(zhì)變化敏感，如 mRNA 濃度、LNP 大小和 PEG 水平，采用自動(dòng)化高通量成像設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)和分析使得該方法評(píng)價(jià)操作簡(jiǎn)易、數(shù)據(jù)獲取客觀，是 mRNA 疫苗研制和生產(chǎn)控制的有效方法，其中疫苗批次的相對(duì)效力可以通過(guò)檢測(cè)樣品與參考樣品的蛋白抗原表達(dá)效率的比較進(jìn)行評(píng)價(jià)，疫苗效力檢測(cè)可以通過(guò)每個(gè)細(xì)胞抗原表達(dá)的定量來(lái)評(píng)價(jià)。
Agilent CLSD 儀器應(yīng)用方案推薦
Cytation7 多模式微孔板成像系統(tǒng)：mRNA-LNP 轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達(dá)高通量成像
Gen5 Image 軟件：自動(dòng)化圖像拼接、細(xì)胞計(jì)數(shù)、抗原蛋白表達(dá)定量分析，EC50 曲線擬合
406FX：微孔板細(xì)胞鋪板、免疫熒光染色操作洗板步驟和分液步驟
其他疫苗相關(guān)應(yīng)用項(xiàng)目支持
Vaccines 2023, 11, 1224. https://doi.org/10.3390/vaccines11071224
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 7 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開(kāi)發(fā)。
mRNA 藥物是一種新型的生物技術(shù)藥物，其歷史可以追溯到 20 世紀(jì) 60 年代。最初科學(xué)家們是期望通過(guò) mRNA 分子來(lái)傳遞基因信息，用以治療惡性腫瘤等疾病。伴隨 2019 年 COVID-19 大流行，mRNA 技術(shù)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展，目前已經(jīng)上市的 mRNA 藥物主要是針對(duì) COVID-19 的感染性疾病疫苗，但是在腫瘤治療領(lǐng)域、致敏性疾病、蛋白替代療法等應(yīng)用領(lǐng)域，也有相當(dāng)多的 mRNA 產(chǎn)品進(jìn)入臨床研究階段。
目前，基于 LNP（核酸脂質(zhì)納米顆粒）遞送載體的技術(shù)是 mRNA 藥物的重要平臺(tái)，該平臺(tái)在其他病原體上的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用是極具潛力的，因此需要更加便捷高效的能夠預(yù)測(cè)疫苗有效性的分析方法和工具，從而評(píng)價(jià)候選 mRNA 疫苗的性能，并將它們與預(yù)期的免疫反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)。
呼吸道合胞病毒 (Respiratory Syncytial Virus, RSV) 是一種常見(jiàn)的病毒，主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，引起嬰幼兒呼吸道感染，目前，預(yù)防 RSV 感染的最有效方法是接種疫苗。然而，由于 RSV 的變異性較強(qiáng)，疫苗的研發(fā)和應(yīng)用還面臨一定的挑戰(zhàn)，因此靶向 RSV-F 蛋白的 mRNA 疫苗極具市場(chǎng)前景。2023 年，默沙東分析方法開(kāi)發(fā)部門(mén) (Analytical Research & Development) 在 Vaccines 上發(fā)表了關(guān)于 mRNA-LNP 技術(shù)體外效價(jià)預(yù)測(cè)評(píng)估的方法學(xué)文章，主要介紹了應(yīng)用高通量成像分析法開(kāi)展 RSV（呼吸道合胞病毒）mRNA-LNP 疫苗效力的方法。
研究方案介紹
該方法主要分為三個(gè)部分，包括細(xì)胞株篩選、細(xì)胞培養(yǎng)單層優(yōu)化和方法學(xué)靈敏度測(cè)試，詳細(xì)介紹了基于 96 孔板 RSV-F 蛋白表達(dá)免疫熒光定量分析方案的有效性和靈敏度。
由于 RSV-F 表達(dá)效率在細(xì)胞系之間差異顯著，研究者首先評(píng)價(jià)了包括 HepG2 在內(nèi)的常用的 6 種細(xì)胞系的適用性。不同細(xì)胞細(xì)接種 96 孔板后，貼壁生長(zhǎng)到 90% 匯合度，加入研究用 mRNA-LNP 疫苗轉(zhuǎn)染孵育 16h 后，固定細(xì)胞，免疫熒光染色法處理樣本，隨后放入 Agilent BioTek Cytation3 設(shè)備中對(duì)所有樣本進(jìn)行同樣標(biāo)準(zhǔn)的熒光圖像采集，并通過(guò) Gen5 軟件分析細(xì)胞內(nèi) RSV-F 蛋白的表達(dá)量。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：其中 A549 細(xì)胞未顯示可檢測(cè)到的蛋白表達(dá)，而 Vero、HeLa、HEp-2 和 CaCo-2 中的 RSV-F 表達(dá)表現(xiàn)出明顯的鉤狀效應(yīng)，在最高劑量下仍只能觀察到非常低的 RSV-F 表達(dá)，表明這些細(xì)胞系 ApoE 產(chǎn)生的有限而致使內(nèi)吞能力較低。加入 ApoE 后能夠逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象（圖 A-G）。
HepG2 細(xì)胞提供了完整的 S 形劑量-反應(yīng)曲線，上漸近線收斂在完全細(xì)胞轉(zhuǎn)染（> 90%）上，可實(shí)現(xiàn)廣泛的動(dòng)態(tài)和劑量反應(yīng)范圍，補(bǔ)充 ApoE 會(huì)導(dǎo)致更陡的斜率，并且提高測(cè)定靈敏度，（EC50 下降 20%，圖 1G）。
圖 1：6 種細(xì)胞株適用性篩選
2. 細(xì)胞單層培養(yǎng)條件優(yōu)化
由于該方案的檢測(cè)方法是高通量成像，需要細(xì)胞樣本以單層培養(yǎng)為佳,但當(dāng) HepG2 匯合度增加時(shí)，細(xì)胞明顯發(fā)生聚集和堆疊（圖 2A）。
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)加入模擬體內(nèi)條件的Ⅰ型膠原包被板上進(jìn)行接種，隨著接種密度的降低明顯看到細(xì)胞單層覆蓋，細(xì)胞密度為 3.0×104 時(shí)提供了最穩(wěn)健的結(jié)果（圖 2D），在該密度下，轉(zhuǎn)染 16h 時(shí)，轉(zhuǎn)染效率> 95%，EC50值 14.0，表明檢測(cè)靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍均大幅提高，最終確定轉(zhuǎn)染 16h 作為最佳效價(jià)測(cè)定時(shí)間（圖 2G）。
圖 2：細(xì)胞單層培養(yǎng)條件優(yōu)化
3. 方法學(xué)靈敏度測(cè)試
抗原 mRNA 易受多種降解反應(yīng)的影響，包括水解和氧化，以及通過(guò)脂質(zhì)加合物形成的化學(xué)修飾，而評(píng)價(jià)不同降解程度的 mRNA 在效力上的損失方法很困難，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)制備了一組不同 N/P 比的樣品(其中，N 指代脂質(zhì)的胺基團(tuán)，P 指代mRNA上的磷酸鹽，D)，來(lái)模擬疫苗的降解，用于評(píng)價(jià)該方法學(xué)對(duì)不同 mRNA 劑量的靈敏度。
研究發(fā)現(xiàn)，而當(dāng) mRNA 量大于 10ng 時(shí)，由于內(nèi)吞作用飽和、mRNA 量受限，細(xì)胞表達(dá) RSV-F 的能力開(kāi)始與 N/P 值呈反比，說(shuō)明該方法對(duì)于 mRNA 表達(dá)是靈敏度良好 (圖 3AB) 并且可以用于監(jiān)測(cè) mRNA 的實(shí)時(shí)降解情況（圖 C）。
圖 3：對(duì)模擬降解樣本的不同 mRNA 含量的 LNP 樣本的效價(jià)檢測(cè)靈敏度驗(yàn)證
此外，PEG 是 LNP 重要組成部分，PEG 層的比例不同，會(huì)影響 LNP 的攝取。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)而評(píng)估了該方法學(xué)對(duì)不同 PEG 濃度和不同 LNP 粒徑的樣本的檢測(cè)靈敏度。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，較大與較小粒徑都會(huì)降低 mRNA-LNP 蛋白表達(dá)，因此應(yīng)首選中間粒徑（100nm±30nm，圖 4B）以保證內(nèi)吞作用更快發(fā)生，而不同 PEG 占比也具有敏感性，將 PEG 含量提高到 1.5% 以上時(shí)，效力下降（圖 4C）。
圖 4：對(duì)不同 LNP 尺寸和 PEG 占比樣本效價(jià)檢測(cè)靈敏度的驗(yàn)證
研究結(jié)論
該 mRNA-LNP 疫苗效價(jià)測(cè)定方法對(duì) LNP 生物學(xué)性質(zhì)變化敏感，如 mRNA 濃度、LNP 大小和 PEG 水平，采用自動(dòng)化高通量成像設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)和分析使得該方法評(píng)價(jià)操作簡(jiǎn)易、數(shù)據(jù)獲取客觀，是 mRNA 疫苗研制和生產(chǎn)控制的有效方法，其中疫苗批次的相對(duì)效力可以通過(guò)檢測(cè)樣品與參考樣品的蛋白抗原表達(dá)效率的比較進(jìn)行評(píng)價(jià)，疫苗效力檢測(cè)可以通過(guò)每個(gè)細(xì)胞抗原表達(dá)的定量來(lái)評(píng)價(jià)。
Agilent CLSD 儀器應(yīng)用方案推薦
Cytation7 多模式微孔板成像系統(tǒng)：mRNA-LNP 轉(zhuǎn)染效率和蛋白表達(dá)高通量成像
Gen5 Image 軟件：自動(dòng)化圖像拼接、細(xì)胞計(jì)數(shù)、抗原蛋白表達(dá)定量分析，EC50 曲線擬合
406FX：微孔板細(xì)胞鋪板、免疫熒光染色操作洗板步驟和分液步驟
其他疫苗相關(guān)應(yīng)用項(xiàng)目支持
- 質(zhì)粒 DNA 濃度檢測(cè)
- LNP 吞噬動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
- LNP 包封率檢測(cè)
- mRNA 疫苗效價(jià) ELISA 測(cè)定
- 中和抗體評(píng)價(jià)
- ELISpot 檢測(cè)
Vaccines 2023, 11, 1224. https://doi.org/10.3390/vaccines11071224
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 7 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)包括xCELLigence RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測(cè)儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺(tái)聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測(cè)和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測(cè)與分析方案開(kāi)發(fā)。
- 生物醫(yī)藥新規(guī)：818號(hào)令與828號(hào)令深度解讀
- 利用徠卡 Mateo FL 實(shí)現(xiàn) 21 CFR Part 11 審計(jì)追蹤與用戶管理
- 基于zenCELL owl 成像解析卵巢癌腹水對(duì)細(xì)胞遷移的影響
- 角膜干細(xì)胞研究的關(guān)鍵——CP-AE細(xì)胞與活細(xì)胞成像儀的結(jié)合
- HoloMonitor細(xì)胞分析軟件在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用
- 顯微課堂： FDA 21 CFR 第 11 部分細(xì)胞培養(yǎng)電子記錄標(biāo)準(zhǔn)詳解
- 顯微課堂：哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞類(lèi)型/組織的介紹
- 類(lèi)器官國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目申請(qǐng)論文撰寫(xiě)的要點(diǎn)分享
- 泰爾茂比司特發(fā)布亞太區(qū)CGT生態(tài)體系藍(lán)圖
- 瑞孚迪“抗體藥研發(fā)全流程試劑應(yīng)用方案”全新上線
- 2026ISFO第二屆國(guó)際類(lèi)器官大會(huì)通知
- IGC 2026免疫基因及細(xì)胞治療大會(huì)重磅嘉賓公布
- 2026冷泉港亞洲會(huì)議|細(xì)菌感染與宿主防御
- 2026冷泉港亞洲會(huì)議|孤獨(dú)癥與神經(jīng)發(fā)育障礙
- 華威中儀推出O2K高精度能量代謝分析儀集文有禮活動(dòng)
- 瑞孚迪聯(lián)合發(fā)起“生物醫(yī)藥新范式創(chuàng)新聯(lián)盟”正式成立
Copyright(C) 1998-2026 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com