ChIP-seq等揭示作物株型穗型發(fā)育調(diào)控新機制 助力表觀遺傳育種馴化
近日，中國農(nóng)業(yè)大學玉米生物育種全國重點實驗室董朝斌教授為第一及共同通訊作者，美國加州大學伯克利分校George Chuck研究員為共同通訊作者，在國際遺傳學Top期刊《Nature Genetics》發(fā)表了題為“A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates contributed to maize domestication”的研究論文。該研究鑒定出新的玉米馴化關鍵基因tasselsheath4（tsh4），并揭示tsh4位于傳統(tǒng)玉米株型穗型馴化調(diào)控網(wǎng)絡上游，闡明了馴化過程中玉米不同發(fā)育時期、不同性狀的分子調(diào)控機理，為進一步開展玉米株型和穗型的遺傳改良提供重要理論指導。
標題：A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates contributed to maize domestication（發(fā)育邊界和分生組織命運的調(diào)控網(wǎng)絡促進玉米馴化）
發(fā)表時間：2024.10.16
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：IF29/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq、GWAS、RNA-seq、miRNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：中國農(nóng)業(yè)大學董朝斌教授、美國加州大學伯克利分校George Chuck研究員、中國農(nóng)業(yè)大學博士生胡高遠、美國北卡州立大學陳秋月博士、美國加州大學伯克利分校Elena Shemyakina博士等。
DOI：10.1038/s41588-024-01943-z
在早期的馴化過程中，農(nóng)民精心選育多種不同的營養(yǎng)和生殖生長性狀的玉米，但由于這些性狀存在異位顯性（epistasis）和功能冗余性，因此其致病位點的鑒定一直未完全確定。本研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和全基因組關聯(lián)分析（GWAS）的整合研究，鑒定出關鍵發(fā)育調(diào)控因子tasselsheath4（tsh4），參與調(diào)控營養(yǎng)生長和花序發(fā)育兩階段性狀，且處于多個已知馴化位點的上游。TSH4作為新的玉米馴化因子，盡管其并不在分生組織中表達，但參與建立發(fā)育邊界并決定分生組織命運。具體而言，TSH4通過雙重負反饋機制發(fā)揮作用，該機制靶向抑制對其負調(diào)控的miRNA（microRNAs）。此外，TSH4與其同源基因存在功能冗余性，協(xié)同正調(diào)控一系列馴化相關位點，同時決定使現(xiàn)代玉米產(chǎn)量翻倍的分生組織�？傊�，TSH4在增產(chǎn)方面起關鍵作用，并助力形成理想的作物株型，從而成為馴化過程中的重要靶點。
研究方法
（1）馴化性狀的全基因組關聯(lián)分析
研究者對866個玉米–野生玉米BC2S3重組自交系和1,257個BC1S4 RILs（TeoNAM群體）進行了16個馴化性狀的QTL-mapping。分析結(jié)果顯示，多個與馴化相關的性狀（如分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)、籽粒重量等）的QTL均定位到tsh4基因所在區(qū)間，表明tsh4是調(diào)控這些馴化性狀的關鍵候選基因（圖1a）。通過比較馴化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，發(fā)現(xiàn)馴化玉米等位基因在減少分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)和提高籽粒重量方面具有顯著效果（圖1b-e）。這些結(jié)果表明，tsh4在玉米馴化過程中起到了重要作用。
研究方法
（1）馴化性狀的全基因組關聯(lián)分析
研究者對866個玉米–野生玉米BC2S3重組自交系和1,257個BC1S4 RILs（TeoNAM群體）進行了16個馴化性狀的QTL-mapping。分析結(jié)果顯示，多個與馴化相關的性狀（如分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)、籽粒重量等）的QTL均定位到tsh4基因所在區(qū)間，表明tsh4是調(diào)控這些馴化性狀的關鍵候選基因（圖1a）。通過比較馴化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，發(fā)現(xiàn)馴化玉米等位基因在減少分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)和提高籽粒重量方面具有顯著效果（圖1b-e）。這些結(jié)果表明，tsh4在玉米馴化過程中起到了重要作用。
圖1：tsh4影響馴化性狀。
a. 在六個不同的W22玉米-野生玉米比對群體中，四個馴化和改良的數(shù)量性狀位點（QTLs）被定位到tsh4基因上。單群體QTL以顯著LOD彩色曲線顯示，多群體聯(lián)合連鎖TeoNAM QTLs顯示在底部。QTL支持區(qū)間以水平條形圖表示。tsh4基因位置由垂直紅線標示。
b-e. 馴化玉米與野生玉米tsh4等位基因效應對比，野生玉米供體親本列在頂部：(b) TILN7.1，(c) STAM7.1，(d) TBN7.2 和 (e) KW7.1。n = RILs的數(shù)量。
f. B73背景下的WT（野生型）、ub2-mum1/ub3-mum1、tsh4-mum1和tsh4-mum1/ub2-mum1/ub3-mum1三重突變體雄穗。在tsh4和三重突變體中移除了最下部苞葉，以揭示分支缺失。
g. WT、ub2-mum1/ub3-mum1、tsh4-mum1和三重突變體果穗。移除最下部苞葉以顯示單籽粒。
h. 分解的WT野生型（左）和三重突變體苞葉腋中的單個小穗（右）。
i. WT B73開花植株與三重突變體植株相比較。星號表示分蘗枝尖。
j. 三重突變體分蘗枝尖特寫，顯示混合性別特征。
k. WT雄穗的花序分生組織（IM）、小穗對分生組織（SPM）、小穗分生組織（SM）和分枝分生組織（BM）的SEM圖像。
l. 去抑制的苞葉及BM或SPM缺失的三重突變體雄穗SEM圖像。
m. 在WT中RA2的免疫定位顯示在SPM中的表達。插圖顯示SM基部表達。
n. 在三重突變體中RA2的免疫定位顯示在形成于分生組織之前的去抑制苞葉基部的異位表達。
o. WT SPM中RA2免疫定位的矢狀視圖，顯示在基部由表達環(huán)形成的邊界。
p. 三重突變體分生組織中RA2免疫定位的矢狀視圖，顯示在苞葉中的異位表達和分生組織表達缺失。
（2）tsh4與ub2和ub3的功能冗余
研究發(fā)現(xiàn)，tsh4與其同源基因ub2和ub3在功能上存在冗余。通過分析ub2/ub3/tsh4三重突變體的雄花序和果穗，發(fā)現(xiàn)三重突變體表現(xiàn)出更嚴重的表型，包括雄花序分支缺失、小花序?qū)θ笔б约胺痔Y數(shù)增加（圖1f-i）。這些表型在單突變體或雙突變體中并未出現(xiàn)，表明tsh4、ub2和ub3在調(diào)控玉米發(fā)育過程中具有協(xié)同作用。
（3）TSH4的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）
為鑒定TSH4的下游靶基因，研究者對3-5mm的B73幼穗原基進行了ChIP-seq分析。兩個生物學重復共鑒定出2,609和3,136個高置信度的結(jié)合peaks，其中1,894個peaks在兩個重復中均被檢測到（圖2a）。這些結(jié)合peaks大多位于基因區(qū)域（80.2%），且富集在GTAC核心結(jié)合位點（圖2b-c）。通過與RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合，研究者發(fā)現(xiàn)TSH4結(jié)合的基因中有263個在tsh4突變體中差異表達，這些基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、植物激素響應和發(fā)育過程（圖2e）。
圖2：利用ChIP-seq鑒定TSH4的直接靶標。
研究發(fā)現(xiàn)，TSH4能夠結(jié)合并激活多個生長素響應基因家族成員，如Aux/IAA基因。這些基因在生長素信號中起負調(diào)控作用，其表達在tsh4、ub2/ub3雙突變體和三重突變體中顯著下調(diào)（圖3c）。通過在三重突變體中引入生長素響應報告基因（DR5rev::mRFPer）和生長素轉(zhuǎn)運報告基因（pZmPIN1a::ZmPIN1a-YFP），研究者發(fā)現(xiàn)三重突變體中生長素響應和轉(zhuǎn)運主要發(fā)生在去抑制苞葉中，而野生型中則主要發(fā)生在分生組織中（圖3d-e）。這表明TSH4通過調(diào)控生長素響應基因，影響苞葉和分生組織的發(fā)育。
研究發(fā)現(xiàn)，TSH4能夠結(jié)合并抑制多個miRNA基因，包括MIR156和MIR529，這些miRNA能夠降解tsh4 mRNA（圖4a-b）。通過miRNA-seq分析，研究者發(fā)現(xiàn)這些miRNA在tsh4、ub2/ub3雙突變體和三重突變體中表達上調(diào)（圖4c）。通過同時進行miRNA原位雜交和TSH4免疫定位，研究者發(fā)現(xiàn)TSH4和MIR529在發(fā)育過程中逐漸建立互斥表達域，從而在分生組織和苞葉之間形成清晰的邊界（圖4e-g）。這種雙重負反饋機制可能是TSH4調(diào)控發(fā)育邊界的關鍵機制。
研究發(fā)現(xiàn)，TSH4能夠結(jié)合并激活多個已知關鍵馴化基因，如tb1、tru1和tga1（圖5a-c）。這些基因在玉米馴化過程中起到了關鍵作用，例如tb1調(diào)控分蘗抑制，tru1調(diào)控側(cè)枝性別決定，tga1調(diào)控穎殼硬度。通過比較馴化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，研究者發(fā)現(xiàn)馴化玉米等位基因在激活這些馴化基因方面更為高效（圖5e）。這表明tsh4在玉米馴化過程中通過調(diào)控多個關鍵基因，促進了理想植物形態(tài)形成。
研究發(fā)現(xiàn)，馴化玉米tsh4等位基因在表達水平上高于野生玉米等位基因，且在激活馴化基因方面更為高效（圖5d-e）。通過對15個野生玉米品系和25個馴化玉米NAM群體的核苷酸多樣性分析，研究者發(fā)現(xiàn)tsh4基因在玉米馴化過程中受到強烈的正選擇（圖5f-g）。這些結(jié)果表明，高表達的玉米tsh4等位基因可能是玉米馴化過程中獲得理想植物形態(tài)的關鍵因子。
結(jié)論和啟示
本研究通過結(jié)合ChIP-seq、GWAS、RNA-seq和miRNA-seq等多種技術(shù)手段，揭示了tsh4在玉米馴化過程中的關鍵作用。tsh4通過調(diào)控多個馴化基因和miRNA，建立了發(fā)育邊界，決定了分生組織命運，并顯著提高了玉米產(chǎn)量。
ChIP-seq技術(shù)在本研究中發(fā)揮了重要作用，通過鑒定TSH4的下游靶基因，揭示了tsh4在調(diào)控玉米發(fā)育和馴化過程中的分子機制。未來類似研究可以利用ChIP-seq技術(shù)，結(jié)合其他組學技術(shù)，深入解析植物馴化和發(fā)育過程中的復雜調(diào)控網(wǎng)絡，為作物改良提供新的理論依據(jù)。
參考文獻：
Dong Z, Hu G, Chen Q, Shemyakina EA, Chau G, Whipple CJ, Fletcher JC, Chuck G. A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates contributed to maize domestication. Nat Genet. 2024 Oct 16. doi: 10.1038/s41588-024-01943-z.
標題：A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates contributed to maize domestication（發(fā)育邊界和分生組織命運的調(diào)控網(wǎng)絡促進玉米馴化）
發(fā)表時間：2024.10.16
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：IF29/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq、GWAS、RNA-seq、miRNA-seq等（易基因金牌技術(shù)）
作者單位：中國農(nóng)業(yè)大學董朝斌教授、美國加州大學伯克利分校George Chuck研究員、中國農(nóng)業(yè)大學博士生胡高遠、美國北卡州立大學陳秋月博士、美國加州大學伯克利分校Elena Shemyakina博士等。
DOI：10.1038/s41588-024-01943-z
在早期的馴化過程中，農(nóng)民精心選育多種不同的營養(yǎng)和生殖生長性狀的玉米，但由于這些性狀存在異位顯性（epistasis）和功能冗余性，因此其致病位點的鑒定一直未完全確定。本研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和全基因組關聯(lián)分析（GWAS）的整合研究，鑒定出關鍵發(fā)育調(diào)控因子tasselsheath4（tsh4），參與調(diào)控營養(yǎng)生長和花序發(fā)育兩階段性狀，且處于多個已知馴化位點的上游。TSH4作為新的玉米馴化因子，盡管其并不在分生組織中表達，但參與建立發(fā)育邊界并決定分生組織命運。具體而言，TSH4通過雙重負反饋機制發(fā)揮作用，該機制靶向抑制對其負調(diào)控的miRNA（microRNAs）。此外，TSH4與其同源基因存在功能冗余性，協(xié)同正調(diào)控一系列馴化相關位點，同時決定使現(xiàn)代玉米產(chǎn)量翻倍的分生組織�？傊�，TSH4在增產(chǎn)方面起關鍵作用，并助力形成理想的作物株型，從而成為馴化過程中的重要靶點。
研究方法
- 植物材料與生長條件：使用tsh4-mum1、ub2-mum1 和 ub3-mum1 突變體植株，通過回交和自交方法將這些突變體引入B73背景中。利用近等基因系（NILs）來比較研究玉米和野生玉米（teosinte）的tsh4等位基因。
- 全基因組關聯(lián)分析（GWAS）：利用866個玉米–野生玉米BC2S3重組自交系（RILs）和1257個BC1S4 RILs（TeoNAM群體），對多個馴化性狀進行QTL-mapping，確定tsh4為候選基因。
- 染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）：通過TSH4抗體對3-5mm的B73幼穗原基進行染色質(zhì)免疫沉淀，鑒定TSH4的下游靶基因。
- 轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq）：對B73、tsh4、ub2/ub3和三重突變體的幼穗組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定差異表達基因（DEGs）。
- 基因表達定量（RT-qPCR）：通過RT-qPCR驗證ChIP-seq和RNA-seq結(jié)果，分析tsh4及其靶基因的表達水平。
- 免疫定位（Immunolocalization）：利用TSH4、UB2/UB3和TB1抗體對馴化玉米和野生玉米的幼穗和分生組織進行免疫定位分析。
- miRNA-seq：分析tsh4、ub2/ub3雙突變體和三重突變體中的miRNA表達水平，鑒定TSH4靶向的miRNA。
- 基因多樣性分析（Diversity Scans）：對馴化玉米、地方品種玉米和野生玉米的tsh4基因進行核苷酸多樣性分析。
（1）馴化性狀的全基因組關聯(lián)分析
研究者對866個玉米–野生玉米BC2S3重組自交系和1,257個BC1S4 RILs（TeoNAM群體）進行了16個馴化性狀的QTL-mapping。分析結(jié)果顯示，多個與馴化相關的性狀（如分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)、籽粒重量等）的QTL均定位到tsh4基因所在區(qū)間，表明tsh4是調(diào)控這些馴化性狀的關鍵候選基因（圖1a）。通過比較馴化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，發(fā)現(xiàn)馴化玉米等位基因在減少分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)和提高籽粒重量方面具有顯著效果（圖1b-e）。這些結(jié)果表明，tsh4在玉米馴化過程中起到了重要作用。
研究方法
- 植物材料與生長條件：使用tsh4-mum1、ub2-mum1 和 ub3-mum1 突變體植株，通過回交和自交方法將這些突變體引入B73背景中。利用近等基因系（NILs）來比較研究玉米和野生玉米（teosinte）的tsh4等位基因。
- 全基因組關聯(lián)分析（GWAS）：利用866個玉米–野生玉米BC2S3重組自交系（RILs）和1257個BC1S4 RILs（TeoNAM群體），對多個馴化性狀進行QTL-mapping，確定tsh4為候選基因。
- 染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）：通過TSH4抗體對3-5mm的B73幼穗原基進行染色質(zhì)免疫沉淀，鑒定TSH4的下游靶基因。
- 轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq）：對B73、tsh4、ub2/ub3和三重突變體的幼穗組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定差異表達基因（DEGs）。
- 基因表達定量（RT-qPCR）：通過RT-qPCR驗證ChIP-seq和RNA-seq結(jié)果，分析tsh4及其靶基因的表達水平。
- 免疫定位（Immunolocalization）：利用TSH4、UB2/UB3和TB1抗體對馴化玉米和野生玉米的幼穗和分生組織進行免疫定位分析。
- miRNA-seq：分析tsh4、ub2/ub3雙突變體和三重突變體中的miRNA表達水平，鑒定TSH4靶向的miRNA。
- 基因多樣性分析（Diversity Scans）：對馴化玉米、地方品種玉米和野生玉米的tsh4基因進行核苷酸多樣性分析。
（1）馴化性狀的全基因組關聯(lián)分析
研究者對866個玉米–野生玉米BC2S3重組自交系和1,257個BC1S4 RILs（TeoNAM群體）進行了16個馴化性狀的QTL-mapping。分析結(jié)果顯示，多個與馴化相關的性狀（如分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)、籽粒重量等）的QTL均定位到tsh4基因所在區(qū)間，表明tsh4是調(diào)控這些馴化性狀的關鍵候選基因（圖1a）。通過比較馴化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，發(fā)現(xiàn)馴化玉米等位基因在減少分蘗數(shù)、雄花序分支數(shù)和提高籽粒重量方面具有顯著效果（圖1b-e）。這些結(jié)果表明，tsh4在玉米馴化過程中起到了重要作用。
圖1：tsh4影響馴化性狀。
b-e. 馴化玉米與野生玉米tsh4等位基因效應對比，野生玉米供體親本列在頂部：(b) TILN7.1，(c) STAM7.1，(d) TBN7.2 和 (e) KW7.1。n = RILs的數(shù)量。
f. B73背景下的WT（野生型）、ub2-mum1/ub3-mum1、tsh4-mum1和tsh4-mum1/ub2-mum1/ub3-mum1三重突變體雄穗。在tsh4和三重突變體中移除了最下部苞葉，以揭示分支缺失。
g. WT、ub2-mum1/ub3-mum1、tsh4-mum1和三重突變體果穗。移除最下部苞葉以顯示單籽粒。
h. 分解的WT野生型（左）和三重突變體苞葉腋中的單個小穗（右）。
i. WT B73開花植株與三重突變體植株相比較。星號表示分蘗枝尖。
j. 三重突變體分蘗枝尖特寫，顯示混合性別特征。
k. WT雄穗的花序分生組織（IM）、小穗對分生組織（SPM）、小穗分生組織（SM）和分枝分生組織（BM）的SEM圖像。
l. 去抑制的苞葉及BM或SPM缺失的三重突變體雄穗SEM圖像。
m. 在WT中RA2的免疫定位顯示在SPM中的表達。插圖顯示SM基部表達。
n. 在三重突變體中RA2的免疫定位顯示在形成于分生組織之前的去抑制苞葉基部的異位表達。
o. WT SPM中RA2免疫定位的矢狀視圖，顯示在基部由表達環(huán)形成的邊界。
p. 三重突變體分生組織中RA2免疫定位的矢狀視圖，顯示在苞葉中的異位表達和分生組織表達缺失。
（2）tsh4與ub2和ub3的功能冗余
研究發(fā)現(xiàn)，tsh4與其同源基因ub2和ub3在功能上存在冗余。通過分析ub2/ub3/tsh4三重突變體的雄花序和果穗，發(fā)現(xiàn)三重突變體表現(xiàn)出更嚴重的表型，包括雄花序分支缺失、小花序?qū)θ笔б约胺痔Y數(shù)增加（圖1f-i）。這些表型在單突變體或雙突變體中并未出現(xiàn)，表明tsh4、ub2和ub3在調(diào)控玉米發(fā)育過程中具有協(xié)同作用。
（3）TSH4的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）
為鑒定TSH4的下游靶基因，研究者對3-5mm的B73幼穗原基進行了ChIP-seq分析。兩個生物學重復共鑒定出2,609和3,136個高置信度的結(jié)合peaks，其中1,894個peaks在兩個重復中均被檢測到（圖2a）。這些結(jié)合peaks大多位于基因區(qū)域（80.2%），且富集在GTAC核心結(jié)合位點（圖2b-c）。通過與RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合，研究者發(fā)現(xiàn)TSH4結(jié)合的基因中有263個在tsh4突變體中差異表達，這些基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、植物激素響應和發(fā)育過程（圖2e）。
圖2：利用ChIP-seq鑒定TSH4的直接靶標。
- 幼穗染色質(zhì)相對于IgG對照的兩個TSH4 ChIP–seq重復之間的重疊分析。
- 大多數(shù)peaks（超過80%）位于基因區(qū)域的全基因組TSH4結(jié)合peaks分布。
- TSH4結(jié)合peaks中GTAC SBP結(jié)合motifs的富集以及相對于peaks頂部位置。
- 相對于基因模型，TSH4結(jié)合peaks的分布。TSS，轉(zhuǎn)錄起始位點；TTS，轉(zhuǎn)錄終止位點。
- ChIP–seq鑒定的所有TSH4靶標與苞葉中LCM RNA-seq和幼穗組織的bulk RNA-seq鑒定的tsh4 DEGs進行重疊分析。
- 在e中鑒定的所有TSH4 ChIP–seq靶標和tsh4 DEGs的功能類別。
研究發(fā)現(xiàn)，TSH4能夠結(jié)合并激活多個生長素響應基因家族成員，如Aux/IAA基因。這些基因在生長素信號中起負調(diào)控作用，其表達在tsh4、ub2/ub3雙突變體和三重突變體中顯著下調(diào)（圖3c）。通過在三重突變體中引入生長素響應報告基因（DR5rev::mRFPer）和生長素轉(zhuǎn)運報告基因（pZmPIN1a::ZmPIN1a-YFP），研究者發(fā)現(xiàn)三重突變體中生長素響應和轉(zhuǎn)運主要發(fā)生在去抑制苞葉中，而野生型中則主要發(fā)生在分生組織中（圖3d-e）。這表明TSH4通過調(diào)控生長素響應基因，影響苞葉和分生組織的發(fā)育。
圖3：TSH4、UB2和UB3調(diào)控生長素響應。
- 兩個TSH4 ChIP–seq重復中Aux/IAA基因鄰近的TSH4結(jié)合譜和TSH4、UB2和UB3 DAP-seq peaks。
- ChIP–qPCR（n=3個生物重復）驗證TSH4 bif4結(jié)合peaks。與p2位點相對于IgG對照（橙色條）相比，位于ChIP–seq peaks的p1擴增區(qū)域在野生型（WT）染色質(zhì)中顯著富集（藍色條）。
- 在tsh4苞葉、tsh4和ub2/ub3突變體以及三重突變體的果穗中Aux/IAA靶基因表達。
- 在WT（左）與三重突變體（右）果穗中的抑制苞葉和SPM生長素響應（Dr5rev::mRFPer）和轉(zhuǎn)運（pZmPIN1a::ZmPIN1a-YFP）。
- WT（左）和三重突變體（右）SPM的矢狀視圖，顯示苞葉（箭頭）中的生長素響應和轉(zhuǎn)運。
研究發(fā)現(xiàn)，TSH4能夠結(jié)合并抑制多個miRNA基因，包括MIR156和MIR529，這些miRNA能夠降解tsh4 mRNA（圖4a-b）。通過miRNA-seq分析，研究者發(fā)現(xiàn)這些miRNA在tsh4、ub2/ub3雙突變體和三重突變體中表達上調(diào)（圖4c）。通過同時進行miRNA原位雜交和TSH4免疫定位，研究者發(fā)現(xiàn)TSH4和MIR529在發(fā)育過程中逐漸建立互斥表達域，從而在分生組織和苞葉之間形成清晰的邊界（圖4e-g）。這種雙重負反饋機制可能是TSH4調(diào)控發(fā)育邊界的關鍵機制。
圖4：TSH4與MIR529之間的雙重負反饋調(diào)控。
- miRNA位點與TSH4結(jié)合peaks之間的重疊。
- miRNA-seq鑒定出在tsh4、雙重突變體和三重突變體中上調(diào)的9個miRNA。
- RT-qPCR檢測成熟miR156和miR529表達，顯示在sbp突變體中上調(diào)。非靶標miR159沒有差異。
- 代表性miRNA基因附近的TSH4結(jié)合譜示例，包括兩個TSH4 ChIP–seq重復以及UB2、UB3和TSH4 DAP-seq peaks。插圖顯示位于peak（p1）和下游（p2）的引物對MIR529 peak的qPCR驗證。
- 在幼穗上的TSH4免疫定位（金色）顯示蛋白在莖、抑制苞葉中，但在IM和SPM中缺失。
- 反義MIR529原位雜交顯示雄穗在SPM中表達，但在苞葉中不表達。插圖顯示了正義對照。
- MIR529反義miRNA原位（藍色）和TSH4抗體（金色）對穗原基的雙重標記。右側(cè)放大插圖在差分干涉對比（DIC）濾鏡下拍攝，顯示在苞葉原基（右上角）中的重疊，但在苞葉抑制階段（右下角）重疊缺失和互補表達。
研究發(fā)現(xiàn)，TSH4能夠結(jié)合并激活多個已知關鍵馴化基因，如tb1、tru1和tga1（圖5a-c）。這些基因在玉米馴化過程中起到了關鍵作用，例如tb1調(diào)控分蘗抑制，tru1調(diào)控側(cè)枝性別決定，tga1調(diào)控穎殼硬度。通過比較馴化玉米和野生玉米的tsh4等位基因，研究者發(fā)現(xiàn)馴化玉米等位基因在激活這些馴化基因方面更為高效（圖5e）。這表明tsh4在玉米馴化過程中通過調(diào)控多個關鍵基因，促進了理想植物形態(tài)形成。
圖5：TSH4靶向馴化位點。
- SBP結(jié)合peak位于tb1啟動子上游58kb處，該位置緊鄰負責馴化的Hopscotch反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)、tru1內(nèi)含子區(qū)和tga1啟動子區(qū)。
- ChIP–qPCR驗證顯示，與啟動子（p2）相比，TSH4結(jié)合peak富集在tru1內(nèi)含子（p1）中。
- 對3周齡B73和三重突變體（tb1和tru1）的幼苗以及吐絲期的果穗（tga1）中馴化基因表達的RT–qPCR分析。
- RT–qPCR比較馴化玉米tsh4與野生玉米tsh4在雄穗和果穗中的表達水平。
- 對馴化玉米/野生玉米NILs果穗組織的RT–qPCR顯示，馴化玉米tsh4等位基因的品系（粉色）中tsh4、tb1和tga1上調(diào)。
- 馴化玉米、玉米地方品種和野生玉米中圍繞tsh4位點區(qū)域的核苷酸多樣性（PI）（上）和Tajima’sD檢驗（下）。垂直灰色虛線表示tsh4轉(zhuǎn)錄起始和終止位點。
- 15個野生玉米品系（紅色）和25個玉米NAM群體自交系（藍色）的序列數(shù)據(jù)評估tsh4基因內(nèi)的核苷酸多樣性（Pi）和Tajima’sD檢驗（頂部，彩色框）。tsh4的第一個內(nèi)含子顯示出最強的選擇信號。下面是tsh4基因模型，顯示相關多態(tài)性位點。實心箭頭表示玉米等位基因相對于野生玉米插入，空心箭頭表示玉米等位基因缺失；氨基酸變化標記在下方。
- 整合miRNA、生長素響應和馴化的tsh4功能模型。
研究發(fā)現(xiàn)，馴化玉米tsh4等位基因在表達水平上高于野生玉米等位基因，且在激活馴化基因方面更為高效（圖5d-e）。通過對15個野生玉米品系和25個馴化玉米NAM群體的核苷酸多樣性分析，研究者發(fā)現(xiàn)tsh4基因在玉米馴化過程中受到強烈的正選擇（圖5f-g）。這些結(jié)果表明，高表達的玉米tsh4等位基因可能是玉米馴化過程中獲得理想植物形態(tài)的關鍵因子。
結(jié)論和啟示
本研究通過結(jié)合ChIP-seq、GWAS、RNA-seq和miRNA-seq等多種技術(shù)手段，揭示了tsh4在玉米馴化過程中的關鍵作用。tsh4通過調(diào)控多個馴化基因和miRNA，建立了發(fā)育邊界，決定了分生組織命運，并顯著提高了玉米產(chǎn)量。
ChIP-seq技術(shù)在本研究中發(fā)揮了重要作用，通過鑒定TSH4的下游靶基因，揭示了tsh4在調(diào)控玉米發(fā)育和馴化過程中的分子機制。未來類似研究可以利用ChIP-seq技術(shù)，結(jié)合其他組學技術(shù)，深入解析植物馴化和發(fā)育過程中的復雜調(diào)控網(wǎng)絡，為作物改良提供新的理論依據(jù)。
參考文獻：
Dong Z, Hu G, Chen Q, Shemyakina EA, Chau G, Whipple CJ, Fletcher JC, Chuck G. A regulatory network controlling developmental boundaries and meristem fates contributed to maize domestication. Nat Genet. 2024 Oct 16. doi: 10.1038/s41588-024-01943-z.
標簽：
ChIP-seq
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