利用ChIP-seq及多組學(xué)解析肝癌侖伐替尼耐藥機(jī)制的研究
近日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院liang bugang、鄭懿民等為并列第一作者，沈英皓、柯愛武為共同通訊作者，在《Hepatology》雜志發(fā)表了題為“The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC”的科研論文。該研究聚焦肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）中侖伐替尼（Lenvatinib）耐藥這一臨床難題，通過一系列實(shí)驗(yàn)探究了其耐藥機(jī)制。研究利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，揭示了微管相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶樣蛋白（Microtubule-associated serine/threonine kinase-like, MASTL）在侖伐替尼耐藥的 HCC 細(xì)胞和組織中高表達(dá)，并通過染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（ChIP-seq）等研究進(jìn)一步揭示應(yīng)激激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 24（Serine/threonine protein kinase 24, STK24）調(diào)控的 MASTL/YBX1/PAK4 軸在 HCC 中介導(dǎo)侖伐替尼耐藥和腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵作用，為突破HCC 侖伐替尼耐藥提供了潛在的治療靶點(diǎn)。
發(fā)表期刊：Hepatology
影響因子：IF15.8/Q1
技術(shù)平臺(tái)：轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、表觀基因組（ChIP-seq）等
作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
DOI：10.1097/HEP.0000000000001392
許多肝細(xì)胞癌（HCC）患者對(duì)侖伐替尼治療反應(yīng)不佳。因此，闡明耐藥的潛在機(jī)制并制定有效的逆轉(zhuǎn)策略至關(guān)重要。本研究首先對(duì)侖伐替尼耐藥的細(xì)胞系和患者來源樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，確定MASTL是與HCC中侖伐替尼耐藥密切相關(guān)的關(guān)鍵因子。隨后，研究人員利用皮下注射小鼠模型、半數(shù)抑制濃度（IC50）實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)，揭示了MASTL在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和介導(dǎo)侖伐替尼耐藥的生物學(xué)功能。為進(jìn)一步闡明潛在機(jī)制，免疫共沉淀和質(zhì)譜分析揭示了MASTL促進(jìn)YBX1蛋白磷酸化。通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP-seq），研究進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸化的YBX1在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)PAK4激活，確定PAK4是MASTL通路的下游效應(yīng)分子。此外，質(zhì)譜分析和磷酸化分析表明，STK24可以在侖伐替尼作用下激活HCC中的MASTL。而阻斷MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸可恢復(fù)HCC對(duì)侖伐替尼的敏感性。
本研究結(jié)果表明，由應(yīng)激誘導(dǎo)的STK24激活MASTL/YBX1/PAK4軸在侖伐替尼耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過靶向MASTL抑制該軸可有效克服HCC中的侖伐替尼耐藥。
易小結(jié)
本研究通過ChIP-seq測(cè)序等分析揭示了MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸在肝細(xì)胞癌（HCC）侖伐替尼耐藥中的關(guān)鍵作用，凸顯了ChIP-seq在解析靶向藥物耐藥機(jī)制中的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，為開發(fā)新的治療策略提供了重要依據(jù)。
未來類似的研究ChIP-seq 技術(shù)可繼續(xù)發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是在探索癌癥耐藥機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)以及研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面，為癌癥治療提供更多的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。
易基因作為領(lǐng)先的表觀基因組技術(shù)提供商，提供包括ATAC-seq、ChIP-seq技術(shù)等在內(nèi)的多種表觀基因組學(xué)技術(shù)，全面滿足不同研究需求，推動(dòng)個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展。
研究方法
結(jié)果圖形
（1）整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥HCC細(xì)胞系和組織中高表達(dá)
研究者們首先通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，比較分析了侖伐替尼耐藥細(xì)胞系（PLC-R和97H-R）與對(duì)照細(xì)胞系（PLC-C和97H-C）的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)差異。分析結(jié)果表明，在97H-R vs 97H-C細(xì)胞系、PLC-R vs PLC-C 細(xì)胞系以及臨床耐藥與敏感 HCC 組織樣本之間，均存在大量差異表達(dá)基因。通過火山圖篩選出符合特定條件（|log2FC|>1且p值<0.05）的DEGs，利用韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)在不同耐藥細(xì)胞系和組織樣本中均上調(diào)的基因，并鑒定出MASTL在多種癌癥中與治療耐藥相關(guān)，且在本研究的耐藥細(xì)胞系和組織樣本中表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步通過免疫組化（IHC）分析臨床HCC組織樣本，揭示MASTL高表達(dá)患者中侖伐替尼治療耐藥比例更高，表明MASTL與侖伐替尼耐藥密切相關(guān)。
圖1：整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥的HCC細(xì)胞系和組織中高表達(dá)。
（A）不同濃度侖伐替尼耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系中侖伐替尼的IC50值。
（B）經(jīng)侖伐替尼處理的耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系的集落形成實(shí)驗(yàn)（n=6）。
（C）經(jīng)侖伐替尼處理后0、24、48、72和96小時(shí)，耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系的細(xì)胞活性。
（D）在接受侖伐替尼治療前被評(píng)估為疾病進(jìn)展（PD）或部分緩解（PR）的患者的MRI圖像。
（E）火山圖顯示在97H-R和97H-C細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定的DEGs。
（F）火山圖顯示在PLC-R和PLC-C細(xì)胞系以及組織樣本之間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定的DEGs。
（G）維恩圖顯示4個(gè)隊(duì)列之間上調(diào)的DEGs重疊分析。
（H）熱圖顯示維恩圖中的重疊基因。
（I）免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)在耐藥細(xì)胞系、對(duì)照細(xì)胞系以及正常肝細(xì)胞系L02中相對(duì)MASTL表達(dá)。
（J）免疫組化顯示在之前PR或PD的HCC組織樣本中相對(duì)MASTL表達(dá)。
（K）TMA3中MASTL的免疫組化染色（左）。通過MASTL表達(dá)分析病例比例（右）。
（2）MASTL過表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)
基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析，揭示MASTL在多種癌癥類型（包括HCC）的腫瘤組織中表達(dá)高于正常組織。對(duì)HCC患者的預(yù)后分析表明，MASTL 高表達(dá)的患者總生存期（OS）更短，且在本研究收集的HCC樣本中，MASTL表達(dá)與惡性表型和不良預(yù)后相關(guān)。多變量邏輯回歸分析表明，MASTL過表達(dá)是 OS 和無病生存期（DFS）的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，強(qiáng)調(diào)MASTL作為HCC預(yù)后標(biāo)志物的潛力。
圖2：MASTL過表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)。
（A）與TCGA數(shù)據(jù)庫中的正常組織相比，不同癌癥類型中的MASTL表達(dá)水平。
（B）點(diǎn)圖顯示TCGA隊(duì)列中50個(gè)原發(fā)性HCC樣本和配對(duì)正常樣本中MASTL的表達(dá)。
（C）分析TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC樣本中MASTL的表達(dá)和患者的總生存期（OS）。
（D）qRT-PCR結(jié)果顯示5個(gè)HCC樣本和配對(duì)正常組織中MASTL的表達(dá)。
（E）通過點(diǎn)圖定量的免疫印跡檢測(cè)5個(gè)HCC和配對(duì)正常組織中MASTL的表達(dá)。
（F）TMA1和TMA2隊(duì)列中H&E染色和MASTL染色的代表性圖像。
（G）TMA1和TMA2隊(duì)列中以IOD值表示的MASTL表達(dá)。
（H-I）基于TMA1和TMA2隊(duì)列中MASTL表達(dá)的總生存期（OS）（H）和無病生存期（DFS）（I）曲線。
（J）區(qū)分HCC腫瘤和正常組織的AUROC值。
（K）熱圖顯示按MASTL表達(dá)分組的270例HCC患者的臨床病理特征。森林圖顯示通過單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析確定的各種表征對(duì)OS和DFS的作用。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
（3）MASTL促進(jìn)HCC細(xì)胞系對(duì)侖伐替尼耐藥及體內(nèi)外腫瘤進(jìn)展
在多種 HCC 細(xì)胞系中檢測(cè) MASTL 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在部分細(xì)胞系中表達(dá)較高。通過構(gòu)建 MASTL 過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn) MASTL 表達(dá)變化直接影響 HCC 細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的敏感性（圖 3C、D），且 MASTL 過表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移、侵襲和自我更新能力，而敲低則抑制這些過程。在體外實(shí)驗(yàn)中，MASTL 過表達(dá)的 HCC 細(xì)胞形成的克隆數(shù)量增多，耐藥性增強(qiáng)；而在體內(nèi)皮下移植瘤模型中，MASTL 敲低顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和侖伐替尼耐藥，過表達(dá)則相反（圖 3E-H）。此外，RNA 測(cè)序分析顯示 MASTL 過表達(dá)激活了 MAPK 信號(hào)通路（圖 3I、J），表明 MASTL 可能通過調(diào)節(jié)該通路促進(jìn) HCC 腫瘤進(jìn)展和耐藥。
圖3：MASTL促進(jìn)HCC細(xì)胞對(duì)侖伐替尼耐藥及體內(nèi)外進(jìn)展。
（A）免疫印跡（上圖）和qRT-PCR（下圖）結(jié)果展示不同HCC細(xì)胞系中相對(duì)的MASTL表達(dá)。
（B）免疫印跡和qRT-PCR結(jié)果展示MHCC97H細(xì)胞中MASTL過表達(dá)以及SNU449細(xì)胞中MASTL敲低的效率。
（C）MASTL過表達(dá)、MASTL敲低和對(duì)照細(xì)胞系中侖伐替尼的IC50值。
（D）MASTL過表達(dá)、MASTL敲低和對(duì)照細(xì)胞系用侖伐替尼處理的集落形成實(shí)驗(yàn)。
（E–H）使用指定細(xì)胞建立皮下腫瘤模型，小鼠接受侖伐替尼或安慰劑治療（n=6）。在指定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)腫瘤體積，終點(diǎn)時(shí)測(cè)量腫瘤重量。
（I）氣泡圖顯示MASTL過表達(dá)細(xì)胞系的KEGG通路分析結(jié)果。
（J）免疫印跡分析顯示指定細(xì)胞系中MAPK信號(hào)通路的激活。
（K）氣泡圖顯示MASTL過表達(dá)細(xì)胞系的GO：BP分析結(jié)果。
（L）差異雙向圖顯示GO：BP分析中“細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控”基因集里排名前10的上調(diào)和下調(diào)基因。
（4）MASTL通過促進(jìn)YBX1磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)（nuclear translocation）促進(jìn)侖伐替尼耐藥
利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，鑒定出MASTL與YBX1存在互作。YBX1是一種在癌癥發(fā)展中起重要作用的蛋白，其在S102位點(diǎn)的磷酸化形式（p-YBX1）是其活性形式，且該位點(diǎn)位于YBX1的冷休克域（Cold-shock domain, CSD）中。研究發(fā)現(xiàn)，MASTL表達(dá)變化直接影響p-YBX1水平和YBX1穩(wěn)定性，且在耐藥細(xì)胞系中YBX1磷酸化水平顯著增加。免疫熒光染色顯示MASTL和p-YBX1在MASTL過表達(dá)細(xì)胞核中強(qiáng)共定位，進(jìn)一步分析細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取物中p-YBX1水平，驗(yàn)證了MASTL過表達(dá)與 YBX1在核內(nèi)的高磷酸化相關(guān)，表明MASTL可磷酸化YBX1，且細(xì)胞核可能是p-YBX1作用的功能場(chǎng)所。
（B）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析MASTL與YBX1的結(jié)合。
（C）銀染法（Silver staining）檢測(cè)MASTL或IgG抗體免疫沉淀的蛋白。
（D）在轉(zhuǎn)染了指定質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中MASTL和YBX1的Co-IP分析。
（E）在侖伐替尼耐藥細(xì)胞（97H-OE、97H-R和PLC-R）和對(duì)照細(xì)胞中YBX1的相對(duì)磷酸化水平Co-IP。（F）在97H-OE和對(duì)照細(xì)胞中MASTL與YBX1或pYBX1共定位的免疫熒光（IF）染色。
（G-H）免疫印跡（G）和qRT-PCR（H）結(jié)果顯示YBX1敲除和YBX1S102A突變體在97H-OE細(xì)胞中的重新表達(dá)效率。
（I）在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的97H-OE細(xì)胞中測(cè)定侖伐替尼的IC50值。
（J）在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的97H-OE細(xì)胞中進(jìn)行的集落形成實(shí)驗(yàn)，顯示侖伐替尼耐藥性變化。
（K）使用轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的MHCC97H細(xì)胞建立皮下腫瘤模型，并用侖伐替尼治療（n=3）。在指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)量腫瘤體積。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
（5）磷酸化YBX1通過轉(zhuǎn)錄激活PAK4促進(jìn)侖伐替尼耐藥
為鑒定YBX1的調(diào)控靶標(biāo)，研究者進(jìn)行RNA-seq測(cè)序和ChIP-seq分析。ChIP-seq結(jié)果揭示在MASTL過表達(dá)的MHCC97H細(xì)胞中，YBX1在基因組上結(jié)合位點(diǎn)增加，尤其在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）附近。通過denovo motifs分析確定了與YBX1結(jié)合密切相關(guān)的motifs，并確定PAK4是YBX1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄靶基因。PAK4在TCGA數(shù)據(jù)庫中與YBX1表達(dá)相關(guān)，且ChIP-seq結(jié)果顯示YBX1在PAK4啟動(dòng)子區(qū)域顯著富集。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PAK4表達(dá)水平在YBX1高磷酸化細(xì)胞中高于低磷酸化細(xì)胞。進(jìn)一步通過構(gòu)建PAK4啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)PAK4啟動(dòng)子的P1（-2000~+100）和P2（-1500~+100）片段激活熒光素酶報(bào)告基因，表明-1500~-1000區(qū)域可以促進(jìn)YBX1介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活。對(duì)該區(qū)域內(nèi)的4個(gè)潛在YBX1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變分析，發(fā)現(xiàn)a、b、c位點(diǎn)的突變會(huì)部分降低YBX1介導(dǎo)的PAK4啟動(dòng)子活性，而d位點(diǎn)突變無影響，同時(shí)突變a、b、c三個(gè)位點(diǎn)則完全消除該活性。此外，在MASTL過表達(dá)且YBX1敲低的細(xì)胞中恢復(fù)PAK4表達(dá)，可以部分消除YBX1敲低導(dǎo)致的侖伐替尼耐藥性降低，表明PAK4是MASTL介導(dǎo)侖伐替尼耐藥的關(guān)鍵效應(yīng)因子。
（B）在MASTL過表達(dá)和對(duì)照MHCC97H細(xì)胞中，按信號(hào)強(qiáng)度排序的高置信度YBX1結(jié)合peaks的ChIP-seq結(jié)果熱圖。
（C）通過ChIP-seq進(jìn)行YBX1的De novo motifs分析，展示97H-OE細(xì)胞中的YBX1結(jié)合motif。紅色方框突出了置信度最高的motif。
（D）ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)之間重疊基因的維恩圖。
（E）根據(jù)ChIP-seq，在MASTL過表達(dá)細(xì)胞中PAK4啟動(dòng)子區(qū)域中YBX1的富集分析。
（F）免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)PAK4表達(dá)。
（G）含有PAK4啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列或片段的相對(duì)熒光素酶活性報(bào)告基因。
（H）所示細(xì)胞含有PAK4啟動(dòng)子突變序列的相對(duì)熒光素酶活性報(bào)告基因。實(shí)心圓代表潛在的YBX1結(jié)合位點(diǎn)，而“X”標(biāo)記突變的YBX1結(jié)合位點(diǎn)。紅色字母表示每個(gè)結(jié)合區(qū)域的潛在或突變的YBX1結(jié)合序列。
（I）qRT-PCR顯示在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的侖伐替尼耐藥細(xì)胞中PAK4的表達(dá)。
（J–L）集落形成實(shí)驗(yàn)顯示在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒后，耐藥細(xì)胞（包括97H-OE（J）、97H-R（K）和PLC-R（L）細(xì)胞）中侖伐替尼耐藥性的變化。
（6）應(yīng)激誘導(dǎo)的STK24激活導(dǎo)致MASTL在S875位點(diǎn)的磷酸化和激活
MASTL存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中T194、T299和S875是常見的保守位點(diǎn)。研究通過構(gòu)建MASTL位點(diǎn)特異性突變體，發(fā)現(xiàn)S875位點(diǎn)突變顯著削弱了MASTL對(duì)YBX1的磷酸化能力，表明S875對(duì)MASTL的激酶活性至關(guān)重要。此外S875突變還降低了細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的耐藥性，并抑制MASTL核轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)合之前研究數(shù)據(jù)，推測(cè)STK24可能是負(fù)責(zé)磷酸化MASTLS875位點(diǎn)的蛋白激酶。免疫熒光染色和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)揭示MASTL與STK24之間的結(jié)合互作。已有研究表明，STK24在氧化應(yīng)激和缺氧條件下可被磷酸化激活，而這些條件通常由多種藥物誘導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，侖伐替尼處理能夠以劑量和時(shí)間依賴性方式激活STK24磷酸化。免疫熒光染色結(jié)果顯示，STK24敲低顯著降低MASTL核轉(zhuǎn)運(yùn)效率，提示STK24可能確實(shí)影響MASTL S875的磷酸化，進(jìn)而調(diào)控MASTL功能。
（B）qRT-PCR結(jié)果顯示不同MASTL突變質(zhì)粒在MHCC97H細(xì)胞中的效率。
（C）免疫印跡顯示不同MASTL突變體的下游效應(yīng)。
（D）在轉(zhuǎn)染了各種MASTL突變質(zhì)粒的MHCC97H細(xì)胞中檢測(cè)IC50值。
（E）集落形成實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染了各種MASTL突變質(zhì)粒的MHCC97H細(xì)胞對(duì)侖伐替尼耐藥性變化。
（F）轉(zhuǎn)染了指定質(zhì)粒的MHCC97H細(xì)胞的免疫熒光（IF）染色。
（G）利用質(zhì)譜和公共激酶數(shù)據(jù)庫鑒定與MASTL互作的激酶蛋白。
（H）通過IF染色檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞中MASTL和STK24的共定位。
（I）在轉(zhuǎn)染了指定質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中MASTL和STK24的共免疫沉淀（Co-IP）。
（J）免疫印跡顯示侖伐替尼處理的STK24磷酸化以劑量和時(shí)間依賴性方式激活。
（K）免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)顯示STK24在MHCC97H細(xì)胞中敲低的效率。
（L） IF染色顯示STK24對(duì)MASTL磷酸化的作用。
（7）通過MKI-1靶向MASTL通過抑制 MASTL/YBX1/PAK4 軸增強(qiáng)體內(nèi)侖伐替尼療效
在臨床樣本中，研究者發(fā)現(xiàn)與配對(duì)正常組織相比，HCC組織中野生型YBX1和磷酸化YBX1水平顯著更高，且它們的表達(dá)與HCC預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，MKI-1能夠以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制MASTL/YBX1/PAK4軸激活。為進(jìn)一步驗(yàn)證MKI-1的體內(nèi)功能，研究者利用侖伐替尼耐藥患者的腫瘤標(biāo)本構(gòu)建了PDX模型，并用MKI-1或安慰劑對(duì)照進(jìn)行治療。結(jié)果表明，MKI-1能夠減少侖伐替尼耐藥腫瘤生長(zhǎng)，突出了靶向MASTL克服侖伐替尼耐藥的治療潛力。隨后，研究者將MKI-1和PAK4抑制劑CZh226聯(lián)合使用，以阻斷MASTL/YBX1/PAK4軸。研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用侖伐替尼效果有限，但MKI-1或CZh226與侖伐替尼聯(lián)合用藥顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。且在原位異種移植腫瘤模型中，未觀察到體重變化或顯著副作用。
此外，為評(píng)估MKI-1聯(lián)合侖伐替尼是否對(duì)高M(jìn)ASTL表達(dá)的HCC患者有效，研究者利用5例MASTL水平最高的患者腫瘤建立了PDX模型。結(jié)果表明，與其它組相比，聯(lián)合治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，表明其作為高M(jìn)ASTL表達(dá)HCC患者治療策略的潛力。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，將MASTL抑制劑MKI-1與侖伐替尼聯(lián)合使用在克服異種移植HCC模型中的侖伐替尼耐藥方面具有顯著效果，表明這種聯(lián)合治療可能是一種有前景的治療策略。
（B）疾病進(jìn)展（PD）患者在侖伐替尼治療前后的組織樣本圖像。用于構(gòu)建PDX小鼠模型。
（C-D）攜帶PDX腫瘤的NSG小鼠接受MKI-1或?qū)φ战M治療。在終點(diǎn)時(shí)獲得圖像（C）和腫瘤重量（D）。
（E–G）97H-R細(xì)胞被皮下注射到BALB/c-nu/nu小鼠體內(nèi)，隨后接受侖伐替尼、MKI-1、CZh226或其聯(lián)合治療。在指定時(shí)間測(cè)量腫瘤體積和重量。
（H–L）原位接種97H-R細(xì)胞的BALB/c-nu/nu小鼠接受侖伐替尼、MKI-1、CZh226或其聯(lián)合治療。展示代表性生物發(fā)光成像（BLI）圖像（H）、生物發(fā)光信號(hào)的動(dòng)態(tài)曲線（I）、原位腫瘤圖像（J）、肝/體重比（%）（K）和小鼠體重（L）。
（M）侖伐替尼通過激活MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)耐藥的分子機(jī)制示意圖。
討論和啟示
本研究深入探討了侖伐替尼在HCC治療中耐藥的分子機(jī)制，揭示了MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸在其中的關(guān)鍵作用。侖伐替尼作為HCC的一線治療藥物，其耐藥問題一直是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)。本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MASTL在耐藥HCC細(xì)胞和組織中高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，MASTL通過磷酸化YBX1促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活PAK4的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)HCC的進(jìn)展和耐藥。此外，研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)激激活的STK24可以磷酸化MASTL的S875位點(diǎn)，激活MASTL的功能。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MASTL抑制劑MKI-1聯(lián)合侖伐替尼能夠顯著抑制耐藥腫瘤的生長(zhǎng)，表明靶向MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸可能是克服侖伐替尼耐藥的有效策略。
本研究的結(jié)果不僅為理解HCC中侖伐替尼耐藥的分子機(jī)制提供了新的見解，還為開發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。MASTL作為一個(gè)關(guān)鍵酶，在多種癌癥中與治療耐藥相關(guān)，其在HCC中的作用機(jī)制的揭示為靶向治療提供了新的方向。此外，本研究還強(qiáng)調(diào)了腫瘤異質(zhì)性在耐藥形成中的重要性，提示未來的研究需要進(jìn)一步探索腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性以及其在耐藥中的作用機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：
Liang BG, Zheng YM, Xu MH, Gao C, Xu WX, Chen JB, Wang SW, Yang GH, Zhao LT, Yuan L, Ma AY, Dong ZN, Cai JB, Sun HC, Ke AW, Shen YH. The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2025 Jun 2. doi: 10.1097/HEP.0000000000001392.
論文標(biāo)題：The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC（應(yīng)激激活的STK24調(diào)控MASTL/YBX1/PAK4軸介導(dǎo)肝細(xì)胞癌侖伐替尼耐藥和腫瘤進(jìn)展）
發(fā)表時(shí)間：2025年6月2日發(fā)表期刊：Hepatology
影響因子：IF15.8/Q1
技術(shù)平臺(tái)：轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、表觀基因組（ChIP-seq）等
作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院
DOI：10.1097/HEP.0000000000001392
許多肝細(xì)胞癌（HCC）患者對(duì)侖伐替尼治療反應(yīng)不佳。因此，闡明耐藥的潛在機(jī)制并制定有效的逆轉(zhuǎn)策略至關(guān)重要。本研究首先對(duì)侖伐替尼耐藥的細(xì)胞系和患者來源樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，確定MASTL是與HCC中侖伐替尼耐藥密切相關(guān)的關(guān)鍵因子。隨后，研究人員利用皮下注射小鼠模型、半數(shù)抑制濃度（IC50）實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)，揭示了MASTL在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和介導(dǎo)侖伐替尼耐藥的生物學(xué)功能。為進(jìn)一步闡明潛在機(jī)制，免疫共沉淀和質(zhì)譜分析揭示了MASTL促進(jìn)YBX1蛋白磷酸化。通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP-seq），研究進(jìn)一步驗(yàn)證磷酸化的YBX1在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)PAK4激活，確定PAK4是MASTL通路的下游效應(yīng)分子。此外，質(zhì)譜分析和磷酸化分析表明，STK24可以在侖伐替尼作用下激活HCC中的MASTL。而阻斷MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸可恢復(fù)HCC對(duì)侖伐替尼的敏感性。
本研究結(jié)果表明，由應(yīng)激誘導(dǎo)的STK24激活MASTL/YBX1/PAK4軸在侖伐替尼耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過靶向MASTL抑制該軸可有效克服HCC中的侖伐替尼耐藥。
圖形摘要
易小結(jié)
本研究通過ChIP-seq測(cè)序等分析揭示了MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸在肝細(xì)胞癌（HCC）侖伐替尼耐藥中的關(guān)鍵作用，凸顯了ChIP-seq在解析靶向藥物耐藥機(jī)制中的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，為開發(fā)新的治療策略提供了重要依據(jù)。
未來類似的研究ChIP-seq 技術(shù)可繼續(xù)發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是在探索癌癥耐藥機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)以及研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面，為癌癥治療提供更多的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。
易基因作為領(lǐng)先的表觀基因組技術(shù)提供商，提供包括ATAC-seq、ChIP-seq技術(shù)等在內(nèi)的多種表觀基因組學(xué)技術(shù)，全面滿足不同研究需求，推動(dòng)個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展。
研究方法
- 細(xì)胞系構(gòu)建：建立侖伐替尼耐藥的 PLC/PRF/5-R（PLC-R）和 MHCC97H-R（97H-R）細(xì)胞系，為后續(xù)研究耐藥機(jī)制提供模型。
- 臨床樣本收集：從接受侖伐替尼治療的 HCC 患者中獲取穿刺活檢樣本，根據(jù)影像學(xué)評(píng)估的腫瘤反應(yīng)情況，將患者分為部分緩解（Partial response, PR）和耐藥（Progressive disease, PD）兩組，同時(shí)收集手術(shù)樣本及組織微陣列（Tissue microarrays, TMAs）。
- 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析：對(duì)耐藥細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes, DEGs），通過火山圖、韋恩圖等分析工具，確定MASTL等關(guān)鍵基因在耐藥細(xì)胞中的異常表達(dá)情況，初步揭示耐藥相關(guān)的分子變化。
- 免疫共沉淀和質(zhì)譜分析：利用免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)合質(zhì)譜（MS）技術(shù)，鑒定與MASTL互作蛋白，進(jìn)一步通過截短突變體構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)，明確MASTL 與YBX1的互作位點(diǎn)，為深入研究MASTL功能及其在耐藥中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
- 染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）：通過 ChIP-seq 技術(shù)檢測(cè)磷酸化YBX1在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合 RNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定出PAK4是YBX1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄靶基因，揭示MASTL通過YBX1調(diào)控PAK4表達(dá)的分子機(jī)制，為解析MASTL信號(hào)軸在耐藥中的作用提供直接證據(jù)。
- 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：建立裸鼠皮下移植瘤模型、原位肝癌模型以及患者來源異種移植瘤（PDX）模型，評(píng)估MASTL對(duì)HCC腫瘤生長(zhǎng)和侖伐替尼耐藥的作用，同時(shí)分析MASTL抑制劑MKI-1單獨(dú)或聯(lián)合侖伐替尼對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果，為臨床應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
結(jié)果圖形
（1）整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥HCC細(xì)胞系和組織中高表達(dá)
研究者們首先通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序分析，比較分析了侖伐替尼耐藥細(xì)胞系（PLC-R和97H-R）與對(duì)照細(xì)胞系（PLC-C和97H-C）的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)差異。分析結(jié)果表明，在97H-R vs 97H-C細(xì)胞系、PLC-R vs PLC-C 細(xì)胞系以及臨床耐藥與敏感 HCC 組織樣本之間，均存在大量差異表達(dá)基因。通過火山圖篩選出符合特定條件（|log2FC|>1且p值<0.05）的DEGs，利用韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)在不同耐藥細(xì)胞系和組織樣本中均上調(diào)的基因，并鑒定出MASTL在多種癌癥中與治療耐藥相關(guān)，且在本研究的耐藥細(xì)胞系和組織樣本中表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步通過免疫組化（IHC）分析臨床HCC組織樣本，揭示MASTL高表達(dá)患者中侖伐替尼治療耐藥比例更高，表明MASTL與侖伐替尼耐藥密切相關(guān)。
圖1：整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥的HCC細(xì)胞系和組織中高表達(dá)。
（B）經(jīng)侖伐替尼處理的耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系的集落形成實(shí)驗(yàn)（n=6）。
（C）經(jīng)侖伐替尼處理后0、24、48、72和96小時(shí)，耐藥細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系的細(xì)胞活性。
（D）在接受侖伐替尼治療前被評(píng)估為疾病進(jìn)展（PD）或部分緩解（PR）的患者的MRI圖像。
（E）火山圖顯示在97H-R和97H-C細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定的DEGs。
（F）火山圖顯示在PLC-R和PLC-C細(xì)胞系以及組織樣本之間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中鑒定的DEGs。
（G）維恩圖顯示4個(gè)隊(duì)列之間上調(diào)的DEGs重疊分析。
（H）熱圖顯示維恩圖中的重疊基因。
（I）免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)在耐藥細(xì)胞系、對(duì)照細(xì)胞系以及正常肝細(xì)胞系L02中相對(duì)MASTL表達(dá)。
（J）免疫組化顯示在之前PR或PD的HCC組織樣本中相對(duì)MASTL表達(dá)。
（K）TMA3中MASTL的免疫組化染色（左）。通過MASTL表達(dá)分析病例比例（右）。
（2）MASTL過表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)
基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析，揭示MASTL在多種癌癥類型（包括HCC）的腫瘤組織中表達(dá)高于正常組織。對(duì)HCC患者的預(yù)后分析表明，MASTL 高表達(dá)的患者總生存期（OS）更短，且在本研究收集的HCC樣本中，MASTL表達(dá)與惡性表型和不良預(yù)后相關(guān)。多變量邏輯回歸分析表明，MASTL過表達(dá)是 OS 和無病生存期（DFS）的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，強(qiáng)調(diào)MASTL作為HCC預(yù)后標(biāo)志物的潛力。
圖2：MASTL過表達(dá)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)。
（B）點(diǎn)圖顯示TCGA隊(duì)列中50個(gè)原發(fā)性HCC樣本和配對(duì)正常樣本中MASTL的表達(dá)。
（C）分析TCGA數(shù)據(jù)庫中HCC樣本中MASTL的表達(dá)和患者的總生存期（OS）。
（D）qRT-PCR結(jié)果顯示5個(gè)HCC樣本和配對(duì)正常組織中MASTL的表達(dá)。
（E）通過點(diǎn)圖定量的免疫印跡檢測(cè)5個(gè)HCC和配對(duì)正常組織中MASTL的表達(dá)。
（F）TMA1和TMA2隊(duì)列中H&E染色和MASTL染色的代表性圖像。
（G）TMA1和TMA2隊(duì)列中以IOD值表示的MASTL表達(dá)。
（H-I）基于TMA1和TMA2隊(duì)列中MASTL表達(dá)的總生存期（OS）（H）和無病生存期（DFS）（I）曲線。
（J）區(qū)分HCC腫瘤和正常組織的AUROC值。
（K）熱圖顯示按MASTL表達(dá)分組的270例HCC患者的臨床病理特征。森林圖顯示通過單變量和多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析確定的各種表征對(duì)OS和DFS的作用。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
（3）MASTL促進(jìn)HCC細(xì)胞系對(duì)侖伐替尼耐藥及體內(nèi)外腫瘤進(jìn)展
在多種 HCC 細(xì)胞系中檢測(cè) MASTL 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在部分細(xì)胞系中表達(dá)較高。通過構(gòu)建 MASTL 過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn) MASTL 表達(dá)變化直接影響 HCC 細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的敏感性（圖 3C、D），且 MASTL 過表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移、侵襲和自我更新能力，而敲低則抑制這些過程。在體外實(shí)驗(yàn)中，MASTL 過表達(dá)的 HCC 細(xì)胞形成的克隆數(shù)量增多，耐藥性增強(qiáng)；而在體內(nèi)皮下移植瘤模型中，MASTL 敲低顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和侖伐替尼耐藥，過表達(dá)則相反（圖 3E-H）。此外，RNA 測(cè)序分析顯示 MASTL 過表達(dá)激活了 MAPK 信號(hào)通路（圖 3I、J），表明 MASTL 可能通過調(diào)節(jié)該通路促進(jìn) HCC 腫瘤進(jìn)展和耐藥。
圖3：MASTL促進(jìn)HCC細(xì)胞對(duì)侖伐替尼耐藥及體內(nèi)外進(jìn)展。
（B）免疫印跡和qRT-PCR結(jié)果展示MHCC97H細(xì)胞中MASTL過表達(dá)以及SNU449細(xì)胞中MASTL敲低的效率。
（C）MASTL過表達(dá)、MASTL敲低和對(duì)照細(xì)胞系中侖伐替尼的IC50值。
（D）MASTL過表達(dá)、MASTL敲低和對(duì)照細(xì)胞系用侖伐替尼處理的集落形成實(shí)驗(yàn)。
（E–H）使用指定細(xì)胞建立皮下腫瘤模型，小鼠接受侖伐替尼或安慰劑治療（n=6）。在指定時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)腫瘤體積，終點(diǎn)時(shí)測(cè)量腫瘤重量。
（I）氣泡圖顯示MASTL過表達(dá)細(xì)胞系的KEGG通路分析結(jié)果。
（J）免疫印跡分析顯示指定細(xì)胞系中MAPK信號(hào)通路的激活。
（K）氣泡圖顯示MASTL過表達(dá)細(xì)胞系的GO：BP分析結(jié)果。
（L）差異雙向圖顯示GO：BP分析中“細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控”基因集里排名前10的上調(diào)和下調(diào)基因。
（4）MASTL通過促進(jìn)YBX1磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)（nuclear translocation）促進(jìn)侖伐替尼耐藥
利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，鑒定出MASTL與YBX1存在互作。YBX1是一種在癌癥發(fā)展中起重要作用的蛋白，其在S102位點(diǎn)的磷酸化形式（p-YBX1）是其活性形式，且該位點(diǎn)位于YBX1的冷休克域（Cold-shock domain, CSD）中。研究發(fā)現(xiàn)，MASTL表達(dá)變化直接影響p-YBX1水平和YBX1穩(wěn)定性，且在耐藥細(xì)胞系中YBX1磷酸化水平顯著增加。免疫熒光染色顯示MASTL和p-YBX1在MASTL過表達(dá)細(xì)胞核中強(qiáng)共定位，進(jìn)一步分析細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取物中p-YBX1水平，驗(yàn)證了MASTL過表達(dá)與 YBX1在核內(nèi)的高磷酸化相關(guān)，表明MASTL可磷酸化YBX1，且細(xì)胞核可能是p-YBX1作用的功能場(chǎng)所。
圖4：MASTL通過促進(jìn)YBX1的磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)侖伐替尼耐藥。
（A）維恩圖顯示質(zhì)譜分析鑒定與MASTL互作的蛋白數(shù)據(jù)、先前發(fā)表的MASTL共免疫沉淀蛋白數(shù)據(jù)集（在HeLa細(xì)胞提取物中）以及通過SILAC篩選預(yù)測(cè)的MASTL底物之間的重疊蛋白。（B）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析MASTL與YBX1的結(jié)合。
（C）銀染法（Silver staining）檢測(cè)MASTL或IgG抗體免疫沉淀的蛋白。
（D）在轉(zhuǎn)染了指定質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中MASTL和YBX1的Co-IP分析。
（E）在侖伐替尼耐藥細(xì)胞（97H-OE、97H-R和PLC-R）和對(duì)照細(xì)胞中YBX1的相對(duì)磷酸化水平Co-IP。（F）在97H-OE和對(duì)照細(xì)胞中MASTL與YBX1或pYBX1共定位的免疫熒光（IF）染色。
（G-H）免疫印跡（G）和qRT-PCR（H）結(jié)果顯示YBX1敲除和YBX1S102A突變體在97H-OE細(xì)胞中的重新表達(dá)效率。
（I）在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的97H-OE細(xì)胞中測(cè)定侖伐替尼的IC50值。
（J）在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的97H-OE細(xì)胞中進(jìn)行的集落形成實(shí)驗(yàn)，顯示侖伐替尼耐藥性變化。
（K）使用轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的MHCC97H細(xì)胞建立皮下腫瘤模型，并用侖伐替尼治療（n=3）。在指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)量腫瘤體積。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
（5）磷酸化YBX1通過轉(zhuǎn)錄激活PAK4促進(jìn)侖伐替尼耐藥
為鑒定YBX1的調(diào)控靶標(biāo)，研究者進(jìn)行RNA-seq測(cè)序和ChIP-seq分析。ChIP-seq結(jié)果揭示在MASTL過表達(dá)的MHCC97H細(xì)胞中，YBX1在基因組上結(jié)合位點(diǎn)增加，尤其在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）附近。通過denovo motifs分析確定了與YBX1結(jié)合密切相關(guān)的motifs，并確定PAK4是YBX1的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄靶基因。PAK4在TCGA數(shù)據(jù)庫中與YBX1表達(dá)相關(guān)，且ChIP-seq結(jié)果顯示YBX1在PAK4啟動(dòng)子區(qū)域顯著富集。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PAK4表達(dá)水平在YBX1高磷酸化細(xì)胞中高于低磷酸化細(xì)胞。進(jìn)一步通過構(gòu)建PAK4啟動(dòng)子區(qū)域的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)PAK4啟動(dòng)子的P1（-2000~+100）和P2（-1500~+100）片段激活熒光素酶報(bào)告基因，表明-1500~-1000區(qū)域可以促進(jìn)YBX1介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活。對(duì)該區(qū)域內(nèi)的4個(gè)潛在YBX1結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變分析，發(fā)現(xiàn)a、b、c位點(diǎn)的突變會(huì)部分降低YBX1介導(dǎo)的PAK4啟動(dòng)子活性，而d位點(diǎn)突變無影響，同時(shí)突變a、b、c三個(gè)位點(diǎn)則完全消除該活性。此外，在MASTL過表達(dá)且YBX1敲低的細(xì)胞中恢復(fù)PAK4表達(dá)，可以部分消除YBX1敲低導(dǎo)致的侖伐替尼耐藥性降低，表明PAK4是MASTL介導(dǎo)侖伐替尼耐藥的關(guān)鍵效應(yīng)因子。
圖5：磷酸化的YBX1通過轉(zhuǎn)錄激活PAK4促進(jìn)侖伐替尼耐藥。
（A）97H-OE和對(duì)照細(xì)胞的DEGs火山圖。（B）在MASTL過表達(dá)和對(duì)照MHCC97H細(xì)胞中，按信號(hào)強(qiáng)度排序的高置信度YBX1結(jié)合peaks的ChIP-seq結(jié)果熱圖。
（C）通過ChIP-seq進(jìn)行YBX1的De novo motifs分析，展示97H-OE細(xì)胞中的YBX1結(jié)合motif。紅色方框突出了置信度最高的motif。
（D）ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)之間重疊基因的維恩圖。
（E）根據(jù)ChIP-seq，在MASTL過表達(dá)細(xì)胞中PAK4啟動(dòng)子區(qū)域中YBX1的富集分析。
（F）免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)PAK4表達(dá)。
（G）含有PAK4啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列或片段的相對(duì)熒光素酶活性報(bào)告基因。
（H）所示細(xì)胞含有PAK4啟動(dòng)子突變序列的相對(duì)熒光素酶活性報(bào)告基因。實(shí)心圓代表潛在的YBX1結(jié)合位點(diǎn)，而“X”標(biāo)記突變的YBX1結(jié)合位點(diǎn)。紅色字母表示每個(gè)結(jié)合區(qū)域的潛在或突變的YBX1結(jié)合序列。
（I）qRT-PCR顯示在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒的侖伐替尼耐藥細(xì)胞中PAK4的表達(dá)。
（J–L）集落形成實(shí)驗(yàn)顯示在轉(zhuǎn)染了指定慢病毒后，耐藥細(xì)胞（包括97H-OE（J）、97H-R（K）和PLC-R（L）細(xì)胞）中侖伐替尼耐藥性的變化。
（6）應(yīng)激誘導(dǎo)的STK24激活導(dǎo)致MASTL在S875位點(diǎn)的磷酸化和激活
MASTL存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中T194、T299和S875是常見的保守位點(diǎn)。研究通過構(gòu)建MASTL位點(diǎn)特異性突變體，發(fā)現(xiàn)S875位點(diǎn)突變顯著削弱了MASTL對(duì)YBX1的磷酸化能力，表明S875對(duì)MASTL的激酶活性至關(guān)重要。此外S875突變還降低了細(xì)胞對(duì)侖伐替尼的耐藥性，并抑制MASTL核轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)合之前研究數(shù)據(jù)，推測(cè)STK24可能是負(fù)責(zé)磷酸化MASTLS875位點(diǎn)的蛋白激酶。免疫熒光染色和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)揭示MASTL與STK24之間的結(jié)合互作。已有研究表明，STK24在氧化應(yīng)激和缺氧條件下可被磷酸化激活，而這些條件通常由多種藥物誘導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)，侖伐替尼處理能夠以劑量和時(shí)間依賴性方式激活STK24磷酸化。免疫熒光染色結(jié)果顯示，STK24敲低顯著降低MASTL核轉(zhuǎn)運(yùn)效率，提示STK24可能確實(shí)影響MASTL S875的磷酸化，進(jìn)而調(diào)控MASTL功能。
圖6：應(yīng)激誘導(dǎo)的STK24激活使MASTL在S875位點(diǎn)磷酸化并激活MASTL功能。
（A）示意圖展示MASTL的常見磷酸化位點(diǎn)以及不同物種的MASTL磷酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸序列。（B）qRT-PCR結(jié)果顯示不同MASTL突變質(zhì)粒在MHCC97H細(xì)胞中的效率。
（C）免疫印跡顯示不同MASTL突變體的下游效應(yīng)。
（D）在轉(zhuǎn)染了各種MASTL突變質(zhì)粒的MHCC97H細(xì)胞中檢測(cè)IC50值。
（E）集落形成實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染了各種MASTL突變質(zhì)粒的MHCC97H細(xì)胞對(duì)侖伐替尼耐藥性變化。
（F）轉(zhuǎn)染了指定質(zhì)粒的MHCC97H細(xì)胞的免疫熒光（IF）染色。
（G）利用質(zhì)譜和公共激酶數(shù)據(jù)庫鑒定與MASTL互作的激酶蛋白。
（H）通過IF染色檢測(cè)MHCC97H細(xì)胞中MASTL和STK24的共定位。
（I）在轉(zhuǎn)染了指定質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中MASTL和STK24的共免疫沉淀（Co-IP）。
（J）免疫印跡顯示侖伐替尼處理的STK24磷酸化以劑量和時(shí)間依賴性方式激活。
（K）免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)顯示STK24在MHCC97H細(xì)胞中敲低的效率。
（L） IF染色顯示STK24對(duì)MASTL磷酸化的作用。
（7）通過MKI-1靶向MASTL通過抑制 MASTL/YBX1/PAK4 軸增強(qiáng)體內(nèi)侖伐替尼療效
在臨床樣本中，研究者發(fā)現(xiàn)與配對(duì)正常組織相比，HCC組織中野生型YBX1和磷酸化YBX1水平顯著更高，且它們的表達(dá)與HCC預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，MKI-1能夠以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制MASTL/YBX1/PAK4軸激活。為進(jìn)一步驗(yàn)證MKI-1的體內(nèi)功能，研究者利用侖伐替尼耐藥患者的腫瘤標(biāo)本構(gòu)建了PDX模型，并用MKI-1或安慰劑對(duì)照進(jìn)行治療。結(jié)果表明，MKI-1能夠減少侖伐替尼耐藥腫瘤生長(zhǎng)，突出了靶向MASTL克服侖伐替尼耐藥的治療潛力。隨后，研究者將MKI-1和PAK4抑制劑CZh226聯(lián)合使用，以阻斷MASTL/YBX1/PAK4軸。研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用侖伐替尼效果有限，但MKI-1或CZh226與侖伐替尼聯(lián)合用藥顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。且在原位異種移植腫瘤模型中，未觀察到體重變化或顯著副作用。
此外，為評(píng)估MKI-1聯(lián)合侖伐替尼是否對(duì)高M(jìn)ASTL表達(dá)的HCC患者有效，研究者利用5例MASTL水平最高的患者腫瘤建立了PDX模型。結(jié)果表明，與其它組相比，聯(lián)合治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，表明其作為高M(jìn)ASTL表達(dá)HCC患者治療策略的潛力。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，將MASTL抑制劑MKI-1與侖伐替尼聯(lián)合使用在克服異種移植HCC模型中的侖伐替尼耐藥方面具有顯著效果，表明這種聯(lián)合治療可能是一種有前景的治療策略。
圖7：通過靶向MASTL的MKI-1抑制MASTL/YBX1/PAK4軸，增強(qiáng)侖伐替尼在體內(nèi)療效。
（A）免疫印跡顯示MKI-1以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制MASTL表達(dá)。（B）疾病進(jìn)展（PD）患者在侖伐替尼治療前后的組織樣本圖像。用于構(gòu)建PDX小鼠模型。
（C-D）攜帶PDX腫瘤的NSG小鼠接受MKI-1或?qū)φ战M治療。在終點(diǎn)時(shí)獲得圖像（C）和腫瘤重量（D）。
（E–G）97H-R細(xì)胞被皮下注射到BALB/c-nu/nu小鼠體內(nèi)，隨后接受侖伐替尼、MKI-1、CZh226或其聯(lián)合治療。在指定時(shí)間測(cè)量腫瘤體積和重量。
（H–L）原位接種97H-R細(xì)胞的BALB/c-nu/nu小鼠接受侖伐替尼、MKI-1、CZh226或其聯(lián)合治療。展示代表性生物發(fā)光成像（BLI）圖像（H）、生物發(fā)光信號(hào)的動(dòng)態(tài)曲線（I）、原位腫瘤圖像（J）、肝/體重比（%）（K）和小鼠體重（L）。
（M）侖伐替尼通過激活MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸在HCC細(xì)胞中誘導(dǎo)耐藥的分子機(jī)制示意圖。
討論和啟示
本研究深入探討了侖伐替尼在HCC治療中耐藥的分子機(jī)制，揭示了MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸在其中的關(guān)鍵作用。侖伐替尼作為HCC的一線治療藥物，其耐藥問題一直是臨床面臨的重大挑戰(zhàn)。本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MASTL在耐藥HCC細(xì)胞和組織中高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，MASTL通過磷酸化YBX1促進(jìn)其核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而激活PAK4的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)HCC的進(jìn)展和耐藥。此外，研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)激激活的STK24可以磷酸化MASTL的S875位點(diǎn)，激活MASTL的功能。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，MASTL抑制劑MKI-1聯(lián)合侖伐替尼能夠顯著抑制耐藥腫瘤的生長(zhǎng)，表明靶向MASTL/YBX1/PAK4信號(hào)軸可能是克服侖伐替尼耐藥的有效策略。
本研究的結(jié)果不僅為理解HCC中侖伐替尼耐藥的分子機(jī)制提供了新的見解，還為開發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。MASTL作為一個(gè)關(guān)鍵酶，在多種癌癥中與治療耐藥相關(guān)，其在HCC中的作用機(jī)制的揭示為靶向治療提供了新的方向。此外，本研究還強(qiáng)調(diào)了腫瘤異質(zhì)性在耐藥形成中的重要性，提示未來的研究需要進(jìn)一步探索腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性以及其在耐藥中的作用機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：
Liang BG, Zheng YM, Xu MH, Gao C, Xu WX, Chen JB, Wang SW, Yang GH, Zhao LT, Yuan L, Ma AY, Dong ZN, Cai JB, Sun HC, Ke AW, Shen YH. The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2025 Jun 2. doi: 10.1097/HEP.0000000000001392.
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