人基因組DNA甲基化長讀長測序檢測方法比較
長讀長測序最常用方法主要包括Oxford Nanopore Technologies（ONT）的納米孔測序和PacBio的單分子實時（SMRT）測序。近日，冰島deCODE Genetics公司/雷克雅未克大學(xué)Brynja D. Sigurpalsdottir等人系統(tǒng)比較了長讀長測序技術(shù)（ONT和SMRT測序）在檢測人基因組DNA甲基化（特別是CpG甲基化）方面的性能。研究共使用7,179個ONT測序樣本、132個精準(zhǔn)甲基化測序（oxBS）樣本和50個SMRT測序樣本，詳細(xì)評估不同測序技術(shù)和分析工具在檢測CpG甲基化（5-mCpG）時的準(zhǔn)確性、一致性及局限性。研究還引入了質(zhì)量過濾器以提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性，并強(qiáng)調(diào)了最新一代ONT R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測中的優(yōu)勢。相關(guān)研究成果以《A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes》為題發(fā)表于《Genome Biology》期刊。
標(biāo)題：A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes（人基因組DNA甲基化長讀長測序檢測方法比較）
發(fā)表時間：2024-03-11
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術(shù)平臺：ONT、oxBS、SMRT
DOI：10.1186/s13059-024-03207-9
本研究揭示了7,179個納米孔測序的DNA樣本中檢測到的CpG甲基化具有高度準(zhǔn)確性和一致性，與相同血液樣本中分離出來的132個精準(zhǔn)甲基化測序（oxBS）樣本的檢測結(jié)果相匹配。研究引入靶向CpG位點的質(zhì)量過濾器(過濾約30%的CpG)以進(jìn)一步提高納米孔測序CpG甲基化檢測的準(zhǔn)確性。研究評估了在不同基因組特征和CpG甲基化率下，每個位點的CpG甲基化檢測性能，并展示了最新的ONT R10.4芯片和堿基識別算法優(yōu)化ONT納米孔測序中的甲基化檢測的具體過程。此外，研究還納入了50個SMRT測序樣本基因組的甲基化檢測結(jié)果和oxBS測序的結(jié)果，與ONT測序進(jìn)行橫向比較研究闡明了每種測序方法的優(yōu)勢和局限性，并為使用長讀長測序進(jìn)行基因組規(guī)模的堿基修飾檢測工具的標(biāo)準(zhǔn)化和評估提出了建議。
研究方法
ONT測序：使用PromethION R9.4和R10.4芯片，通過檢測DNA分子通過納米孔時的電流變化來識別甲基化修飾。
SMRT測序：通過檢測DNA合成過程中堿基摻入的動力學(xué)變化來識別甲基化修飾。
oxBS測序：通過化學(xué)氧化和亞硫酸鹽處理精準(zhǔn)區(qū)分5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。
數(shù)據(jù)分析工具：
結(jié)果圖形
（1）ONT納米孔測序檢測CpG甲基化
研究首先利用promethION平臺對7,179名個體全血樣本進(jìn)行Nanopore測序，平均測序度為20.6×（中位數(shù)為19.5×，范圍從10×到108×）。同一樣本還被用于研究CpG甲基化、基因表達(dá)和序列變異之間的相關(guān)性。研究通過Nanopolish工具進(jìn)行CpG甲基化檢測，該工具將相距10bp以內(nèi)的CpG位點歸為一個單元，稱為CpG單元。Nanopolish以參考基因組比對的reads為input和每個read數(shù)據(jù)參考基因組的鏈信息，為每個CpG單元判斷其對數(shù)似然比（LLR）。LLR為二進(jìn)制值，表示測序CpG位點甲基化狀態(tài)。當(dāng)LLR未達(dá)到預(yù)測CpG單元為甲基化或未甲基化標(biāo)準(zhǔn)時，將CpG單元分類為“不可靠”。本研究分析范圍為隊列中Nanopolish檢測到的22,178,458個常染色體CpG單元，共27,651,488個CpG位點。
（2）ONT測序和oxBS的CpG甲基化檢測比較
研究對132個個體的DNA樣本進(jìn)行Nanopore測序和oxBS測序比較分析以評估Nanopore測序在CpG甲基化檢測中的準(zhǔn)確性。樣本平均測序深度為25×，每個CpG單元在兩個數(shù)據(jù)集中分別計算了所有個體的平均5-mCpG率，并通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）來評估Nanopolish工具性能。結(jié)果顯示，兩個數(shù)據(jù)集之間的APC非常高（r=0.9594），表明Nanopore測序的甲基化檢測結(jié)果與oxBS測序結(jié)果高度一致。
圖1：ONT測序和oxBS在同一DNA樣本中5-甲基胞嘧啶（5-mCpG）率的一致性表現(xiàn)。
A. 132個DNA樣本中ONT（紅色）和oxBS（綠色）的5-mCpG率整體檢測值。
B-C. ONT測序中每個CpG位點的5-mCpG率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)r（B）和平均絕對差異（MAD）（C）。
D. ONT測序樣本中用于分析特定CpG位點的5-mCpG率的序列數(shù)量（X軸），影響與oxBS高深度檢測5-mCpG率的一致性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r，Y軸）。
E. ONT測序（Y軸）和oxBS（X軸，分組）中的CpG率。平均值紅色（ONT）和綠色（oxBS）。
F. 樣本間比較通過ONT測序正確分類的CpG位點數(shù)量（Y軸，單位=/M CpGs，藍(lán)色）。錯誤分類的CpG位點根據(jù)5-mCpG率的MAD著色（顏色圖例）。D/E/F中的oxBS位點測序深度>25×。
（3）測序深度影響ONT測序數(shù)據(jù)中CpG甲基化檢測的一致性
研究進(jìn)一步探討了測序深度對Nanopore測序CpG甲基化檢測一致性的影響。結(jié)果顯示，測序深度越高，CpG甲基化檢測一致性越好。當(dāng)測序深度在12×或更高時，皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯著提高，而20×或更高的測序深度時，檢測結(jié)果一致性進(jìn)一步提高。當(dāng)測序深度低于10×時，甲基化檢測準(zhǔn)確性會顯著下降。這一結(jié)果表明，較高的測序深度能夠顯著提高CpG甲基化檢測的準(zhǔn)確性和一致性。為了獲得高準(zhǔn)確性的CpG甲基化檢測結(jié)果，建議每個樣本的測序深度至少為12×，20×或更高則更為理想。
（4）ONT測序數(shù)據(jù)在未甲基化和高甲基化CpG單元中的一致性更高
研究發(fā)現(xiàn)，ONT測序在未甲基化和高甲基化CpG單元的檢測上表現(xiàn)更為一致。研究將CpG位點分為未甲基化（0–0.15）、低甲基化（0.15–0.5）、中等甲基化（0.5–0.85）和高甲基化（0.85–1）四個類別，通過比較ONT測序和oxBS的結(jié)果顯示，Nanopore測序在未甲基化和高甲基化CpG單元上的預(yù)測準(zhǔn)確性最高，分別為86%和77%。這表明Nanopore測序在極端甲基化狀態(tài)下檢測更為可靠，而在低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的檢測準(zhǔn)確性相對較低，分別為52%和56%。這一結(jié)果為研究者在選擇測序技術(shù)和分析工具時提供重要的參考依據(jù)。
（5）Nanopolish甲基化檢測質(zhì)量受CpG單元序列背景影響
研究發(fā)現(xiàn)，Nanopolish甲基化檢測質(zhì)量受CpG單元序列背景的影響。為了分析這種影響，研究者將CpG單元分為序列變異周圍（5bp以內(nèi)）、“暗區(qū)”（即難以可靠比對的區(qū)域）、具有異常測序深度（高于平均深度1.5倍或低于平均深度0.5倍）以及存在鏈偏倚（大于0.2）的4個CpG單元。分析結(jié)果表明，序列變異周圍CpG位點（5bp以內(nèi)）的預(yù)測準(zhǔn)確性較低，其APC為0.9219，而其他CpG位點的APC為0.9656。此外，“暗區(qū)”CpG位點APC也較低，為0.698。這些結(jié)果表明，序列背景對Nanopore測序的甲基化檢測準(zhǔn)確性有顯著影響。因此，在進(jìn)行CpG甲基化檢測時，需要特別關(guān)注這些區(qū)域的質(zhì)控，以提高檢測結(jié)果的可靠性。
圖2：根據(jù)DNA序列屬性評估5-mCpG率檢測質(zhì)量。
A. 比較位于特定序列屬性內(nèi)部（灰色）和外部（粉色）的CpG位點的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）。
B. 每個屬性內(nèi)部的CpG單元（紅色）和位點（綠色）數(shù)量。
C. 單個CpG單元（單例）和多CpG位點單元（非單例）中高質(zhì)量（深藍(lán)色）與非高質(zhì)量（淺藍(lán)色）CpG單元的比例。
D. 不同甲基化狀態(tài)類別中高質(zhì)量和非高質(zhì)量CpG單元比例。
（6）與oxBS數(shù)據(jù)的對比分析中，Guppy在CpG位點甲基化檢測上表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish
研究比較了Guppy和Nanopolish在CpG位點的甲基化檢測。分析結(jié)果表明Guppy在與oxBS測序結(jié)果的對比分析中表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish。具體而言，Guppy與oxBS測序結(jié)果的APC為0.97256，高于Nanopolish的0.9594。且Guppy平均鏈偏倚更低，表明其甲基化檢測準(zhǔn)確性更高。通過應(yīng)用與Nanopolish相同的質(zhì)量過濾器，Guppy能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點（hq-CpGs），其APC為0.98691。這一結(jié)果表明，Guppy在CpG甲基化檢測上具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性，特別是在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點時表現(xiàn)更為出色。
（7）最新的Nanopore R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測上實現(xiàn)了更高準(zhǔn)確性和改進(jìn)的檢測結(jié)果
研究人員對ONT的最新R10.4芯片在CpG甲基化檢測方面的表現(xiàn)進(jìn)行了評估，并與早期的R9.4芯片進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，R10.4芯片在多個方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，特別是在提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性和減少鏈偏倚方面。
（8）ONT測序與SMRT測序的CpG甲基化檢測比較
研究以50個oxBS樣本作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對50個SMRT測序樣本、50個ONT測序樣本（分別使用R9.4和R10.4芯片）的CpG甲基化檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。研究對所有樣本的平均5-mCpG率進(jìn)行分析，并比較所有五種方法（SMRT、R9.4-Guppy、R10.4-Guppy、R9.4-Nanopolish和oxBS）之間的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）以及5-mCpG率與oxBS之間的平均絕對差異（MAD）（表1A）。
表1：不同測序技術(shù)在CpG甲基化檢測中的一致性和準(zhǔn)確性比較
(A) APC比較結(jié)果展示在主對角線以下，MMAD比較結(jié)果展示在主對角線以上。
(B) 基于所有CpG、序列變異周圍CpG或暗區(qū)CpG位點的APC比較分析。
結(jié)果顯示，Guppy R10.4和Guppy R9.4在與oxBS數(shù)據(jù)的比較中表現(xiàn)最佳，其平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）最高，分別為0.97845和0.97256。表明Guppy在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性最高，能夠最接近oxBS測序的參考標(biāo)準(zhǔn)。研究還分析了不同測序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。所有測序技術(shù)均能準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)oxBS測序觀察到的CpG甲基化率的雙峰分布，Guppy R10.4的分布與oxBS測序結(jié)果最為接近，表明其在極端甲基化狀態(tài)下的檢測更為準(zhǔn)確。
此外，CpG周圍的序列變異會在oxBS中引入比對偏倚，導(dǎo)致甲基化檢測不準(zhǔn)確和APC降低（表1B）。因此對于Guppy和PacBio而言，序列變異周圍CpG位點的重要性較低。所有長讀長測序技術(shù)都使用特定序列背景和與參考基因組的比較來檢測CpG甲基化狀態(tài)，因此可以過濾那些序列變異周圍的CpG位點。
（9）5-mCpG率的分布
研究分析了不同測序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。結(jié)果顯示，所有測序技術(shù)在CpG甲基化率的分布上表現(xiàn)出預(yù)期的雙峰分布，但在完全甲基化和完全未甲基化狀態(tài)下的分布略有差異。Guppy R10.4測序結(jié)果與oxBS測序結(jié)果最為接近，而SMRT測序和Guppy R9.4測序結(jié)果則在極端甲基化狀態(tài)下表現(xiàn)出一定的偏倚。這一結(jié)果表明，不同測序技術(shù)在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點時可能存在差異，研究者在選擇測序技術(shù)時需要考慮這些因素。
B. 在oxBS、PacBio和Nanopore中，CpG甲基化率（0-1）在個體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。
C. 全血中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）的CpG甲基化率在50bp范圍內(nèi)平均值。
D. 每種方法檢測到的CpG位點數(shù)量。Nanopolish統(tǒng)計每個CpG單元的所有CpG位點。
（10）功能區(qū)域的5-mCpG分布
為了研究生物學(xué)背景對甲基化檢測準(zhǔn)確性的作用，研究人員分析了全血中表達(dá)基因的TSS處50bp以內(nèi)的平均5-mCpG率。所有甲基化檢測方法都高度匹配oxBS測序樣本中的甲基化模式，表明在TSS區(qū)域內(nèi)甲基化缺失（圖3C）。其中PacBio和Guppy R9.4在TSS處顯示出更高的CpG甲基化率，而在TSS之外則顯示出低甲基化率，這與這兩種方法的甲基化分布輕微偏移一致（圖3A、B）。而Guppy R10.4測序結(jié)果更接近于oxBS中的TSS甲基化水平（圖3C）。表明其在功能區(qū)域的甲基化檢測上具有高準(zhǔn)確性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了Guppy R10.4測序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用潛力，特別是在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞分化機(jī)制研究中。
（11）長讀長測序比oxBS測序檢測到更多的CpG位點數(shù)量
研究發(fā)現(xiàn)，長讀長測序技術(shù)在檢測CpG位點數(shù)量上優(yōu)于oxBS測序。Nanopore測序和SMRT測序平均每個樣本檢測到約27M CpG位點（Guppy R9.4=27,467,383個CpG位點，Guppy R10.4=27369144個CpG位點，PacBio=26,739,539個CpG位點，Nanopolish=26,487,587個CpG位點，分布在22,058,476個CpG單元中），而oxBS測序僅檢測到約26M CpG位點（圖3D）。這一結(jié)果表明，長讀長測序技術(shù)在CpG甲基化檢測上具有更高的分辨率和更全面的覆蓋范圍，能夠為研究者提供更豐富的表觀遺傳學(xué)信息。這一優(yōu)勢在研究復(fù)雜基因組區(qū)域和稀有甲基化中尤為顯著。
討論和啟示
本研究通過大規(guī)模樣本分析，揭示了長讀長測序技術(shù)在CpG甲基化檢測中的優(yōu)勢和局限性。研究揭示了測序深度、鏈偏倚、序列背景等因素對甲基化檢測的準(zhǔn)確性有顯著影響。同時，長讀長測序技術(shù)在檢測CpG甲基化方面具有顯著優(yōu)勢，尤其是在無需化學(xué)處理DNA的情況下直接檢測甲基化修飾的能力。最新的R10.4芯片技術(shù)，通過降低鏈偏倚和提高檢測準(zhǔn)確性，進(jìn)一步提升了ONT測序在甲基化檢測中的性能。未來的研究可以利用這些技術(shù)優(yōu)勢，深入探索基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化以及疾病發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域的表觀遺傳學(xué)變化。
參考文獻(xiàn)：
Sigurpalsdottir, B.D., Stefansson, O.A., Holley, G. et al. A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes. Genome Biol 25, 69 (2024). Doi：10.1186/s13059-024-03207-9
標(biāo)題：A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes（人基因組DNA甲基化長讀長測序檢測方法比較）
發(fā)表時間：2024-03-11
發(fā)表期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術(shù)平臺：ONT、oxBS、SMRT
DOI：10.1186/s13059-024-03207-9
本研究揭示了7,179個納米孔測序的DNA樣本中檢測到的CpG甲基化具有高度準(zhǔn)確性和一致性，與相同血液樣本中分離出來的132個精準(zhǔn)甲基化測序（oxBS）樣本的檢測結(jié)果相匹配。研究引入靶向CpG位點的質(zhì)量過濾器(過濾約30%的CpG)以進(jìn)一步提高納米孔測序CpG甲基化檢測的準(zhǔn)確性。研究評估了在不同基因組特征和CpG甲基化率下，每個位點的CpG甲基化檢測性能，并展示了最新的ONT R10.4芯片和堿基識別算法優(yōu)化ONT納米孔測序中的甲基化檢測的具體過程。此外，研究還納入了50個SMRT測序樣本基因組的甲基化檢測結(jié)果和oxBS測序的結(jié)果，與ONT測序進(jìn)行橫向比較研究闡明了每種測序方法的優(yōu)勢和局限性，并為使用長讀長測序進(jìn)行基因組規(guī)模的堿基修飾檢測工具的標(biāo)準(zhǔn)化和評估提出了建議。
研究方法
ONT測序：使用PromethION R9.4和R10.4芯片，通過檢測DNA分子通過納米孔時的電流變化來識別甲基化修飾。
SMRT測序：通過檢測DNA合成過程中堿基摻入的動力學(xué)變化來識別甲基化修飾。
oxBS測序：通過化學(xué)氧化和亞硫酸鹽處理精準(zhǔn)區(qū)分5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）。
數(shù)據(jù)分析工具：
- Nanopolish：使用隱馬爾可夫模型（HMM）為每個CpG位點分配甲基化狀態(tài)。
- Guppy：基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）工具，可在堿基識別階段直接檢測CpG甲基化。
- Primrose：SMRT測序數(shù)據(jù)的甲基化檢測，通過結(jié)合鄰近CpG位點的動態(tài)信息來提高檢測準(zhǔn)確性。
結(jié)果圖形
（1）ONT納米孔測序檢測CpG甲基化
研究首先利用promethION平臺對7,179名個體全血樣本進(jìn)行Nanopore測序，平均測序度為20.6×（中位數(shù)為19.5×，范圍從10×到108×）。同一樣本還被用于研究CpG甲基化、基因表達(dá)和序列變異之間的相關(guān)性。研究通過Nanopolish工具進(jìn)行CpG甲基化檢測，該工具將相距10bp以內(nèi)的CpG位點歸為一個單元，稱為CpG單元。Nanopolish以參考基因組比對的reads為input和每個read數(shù)據(jù)參考基因組的鏈信息，為每個CpG單元判斷其對數(shù)似然比（LLR）。LLR為二進(jìn)制值，表示測序CpG位點甲基化狀態(tài)。當(dāng)LLR未達(dá)到預(yù)測CpG單元為甲基化或未甲基化標(biāo)準(zhǔn)時，將CpG單元分類為“不可靠”。本研究分析范圍為隊列中Nanopolish檢測到的22,178,458個常染色體CpG單元，共27,651,488個CpG位點。
（2）ONT測序和oxBS的CpG甲基化檢測比較
研究對132個個體的DNA樣本進(jìn)行Nanopore測序和oxBS測序比較分析以評估Nanopore測序在CpG甲基化檢測中的準(zhǔn)確性。樣本平均測序深度為25×，每個CpG單元在兩個數(shù)據(jù)集中分別計算了所有個體的平均5-mCpG率，并通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）來評估Nanopolish工具性能。結(jié)果顯示，兩個數(shù)據(jù)集之間的APC非常高（r=0.9594），表明Nanopore測序的甲基化檢測結(jié)果與oxBS測序結(jié)果高度一致。
圖1：ONT測序和oxBS在同一DNA樣本中5-甲基胞嘧啶（5-mCpG）率的一致性表現(xiàn)。
B-C. ONT測序中每個CpG位點的5-mCpG率的皮爾遜相關(guān)系數(shù)r（B）和平均絕對差異（MAD）（C）。
D. ONT測序樣本中用于分析特定CpG位點的5-mCpG率的序列數(shù)量（X軸），影響與oxBS高深度檢測5-mCpG率的一致性（皮爾遜相關(guān)系數(shù)r，Y軸）。
E. ONT測序（Y軸）和oxBS（X軸，分組）中的CpG率。平均值紅色（ONT）和綠色（oxBS）。
F. 樣本間比較通過ONT測序正確分類的CpG位點數(shù)量（Y軸，單位=/M CpGs，藍(lán)色）。錯誤分類的CpG位點根據(jù)5-mCpG率的MAD著色（顏色圖例）。D/E/F中的oxBS位點測序深度>25×。
（3）測序深度影響ONT測序數(shù)據(jù)中CpG甲基化檢測的一致性
研究進(jìn)一步探討了測序深度對Nanopore測序CpG甲基化檢測一致性的影響。結(jié)果顯示，測序深度越高，CpG甲基化檢測一致性越好。當(dāng)測序深度在12×或更高時，皮爾遜相關(guān)系數(shù)顯著提高，而20×或更高的測序深度時，檢測結(jié)果一致性進(jìn)一步提高。當(dāng)測序深度低于10×時，甲基化檢測準(zhǔn)確性會顯著下降。這一結(jié)果表明，較高的測序深度能夠顯著提高CpG甲基化檢測的準(zhǔn)確性和一致性。為了獲得高準(zhǔn)確性的CpG甲基化檢測結(jié)果，建議每個樣本的測序深度至少為12×，20×或更高則更為理想。
（4）ONT測序數(shù)據(jù)在未甲基化和高甲基化CpG單元中的一致性更高
研究發(fā)現(xiàn)，ONT測序在未甲基化和高甲基化CpG單元的檢測上表現(xiàn)更為一致。研究將CpG位點分為未甲基化（0–0.15）、低甲基化（0.15–0.5）、中等甲基化（0.5–0.85）和高甲基化（0.85–1）四個類別，通過比較ONT測序和oxBS的結(jié)果顯示，Nanopore測序在未甲基化和高甲基化CpG單元上的預(yù)測準(zhǔn)確性最高，分別為86%和77%。這表明Nanopore測序在極端甲基化狀態(tài)下檢測更為可靠，而在低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的檢測準(zhǔn)確性相對較低，分別為52%和56%。這一結(jié)果為研究者在選擇測序技術(shù)和分析工具時提供重要的參考依據(jù)。
（5）Nanopolish甲基化檢測質(zhì)量受CpG單元序列背景影響
研究發(fā)現(xiàn)，Nanopolish甲基化檢測質(zhì)量受CpG單元序列背景的影響。為了分析這種影響，研究者將CpG單元分為序列變異周圍（5bp以內(nèi)）、“暗區(qū)”（即難以可靠比對的區(qū)域）、具有異常測序深度（高于平均深度1.5倍或低于平均深度0.5倍）以及存在鏈偏倚（大于0.2）的4個CpG單元。分析結(jié)果表明，序列變異周圍CpG位點（5bp以內(nèi)）的預(yù)測準(zhǔn)確性較低，其APC為0.9219，而其他CpG位點的APC為0.9656。此外，“暗區(qū)”CpG位點APC也較低，為0.698。這些結(jié)果表明，序列背景對Nanopore測序的甲基化檢測準(zhǔn)確性有顯著影響。因此，在進(jìn)行CpG甲基化檢測時，需要特別關(guān)注這些區(qū)域的質(zhì)控，以提高檢測結(jié)果的可靠性。
圖2：根據(jù)DNA序列屬性評估5-mCpG率檢測質(zhì)量。
B. 每個屬性內(nèi)部的CpG單元（紅色）和位點（綠色）數(shù)量。
C. 單個CpG單元（單例）和多CpG位點單元（非單例）中高質(zhì)量（深藍(lán)色）與非高質(zhì)量（淺藍(lán)色）CpG單元的比例。
D. 不同甲基化狀態(tài)類別中高質(zhì)量和非高質(zhì)量CpG單元比例。
（6）與oxBS數(shù)據(jù)的對比分析中，Guppy在CpG位點甲基化檢測上表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish
研究比較了Guppy和Nanopolish在CpG位點的甲基化檢測。分析結(jié)果表明Guppy在與oxBS測序結(jié)果的對比分析中表現(xiàn)優(yōu)于Nanopolish。具體而言，Guppy與oxBS測序結(jié)果的APC為0.97256，高于Nanopolish的0.9594。且Guppy平均鏈偏倚更低，表明其甲基化檢測準(zhǔn)確性更高。通過應(yīng)用與Nanopolish相同的質(zhì)量過濾器，Guppy能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點（hq-CpGs），其APC為0.98691。這一結(jié)果表明，Guppy在CpG甲基化檢測上具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性，特別是在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點時表現(xiàn)更為出色。
（7）最新的Nanopore R10.4芯片技術(shù)在甲基化檢測上實現(xiàn)了更高準(zhǔn)確性和改進(jìn)的檢測結(jié)果
研究人員對ONT的最新R10.4芯片在CpG甲基化檢測方面的表現(xiàn)進(jìn)行了評估，并與早期的R9.4芯片進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，R10.4芯片在多個方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，特別是在提高甲基化檢測的準(zhǔn)確性和減少鏈偏倚方面。
- 更高的APC：在所有CpG位點中，R10.4芯片預(yù)測的5-mCpG率與oxBS數(shù)據(jù)的APC為0.97845，高于R9.4芯片的0.97256。表明R10.4芯片在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性更高。
- 更低的MAD：Guppy R10.4在與oxBS的甲基化檢測比較中顯示出比Guppy R9.4更低的MAD，進(jìn)一步證明了其在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性。
- 更低的鏈偏倚：R10.4芯片的平均鏈偏倚為0.047，顯著低于R9.4芯片的0.064。鏈偏倚是指正鏈和負(fù)鏈上預(yù)測的甲基化率差異，較低的鏈偏倚表明R10.4芯片在甲基化檢測上的可靠性更高。
- 更多的高質(zhì)量CpG位點：應(yīng)用相同的質(zhì)量過濾器，R10.4芯片能夠鑒定出更多的高質(zhì)量CpG位點（hq-CpGs），數(shù)量達(dá)到22893522個（82.8%），與R9.4芯片相比增加了2.3%。表明R10.4芯片在提高甲基化檢測位點覆蓋率方面具有顯著優(yōu)勢。
- 高質(zhì)量CpG位點更高的APC：這些高質(zhì)量CpG位點的APC為0.99067，表明R10.4芯片在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性非常高。
（8）ONT測序與SMRT測序的CpG甲基化檢測比較
研究以50個oxBS樣本作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對50個SMRT測序樣本、50個ONT測序樣本（分別使用R9.4和R10.4芯片）的CpG甲基化檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。研究對所有樣本的平均5-mCpG率進(jìn)行分析，并比較所有五種方法（SMRT、R9.4-Guppy、R10.4-Guppy、R9.4-Nanopolish和oxBS）之間的平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）以及5-mCpG率與oxBS之間的平均絕對差異（MAD）（表1A）。
表1：不同測序技術(shù)在CpG甲基化檢測中的一致性和準(zhǔn)確性比較(B) 基于所有CpG、序列變異周圍CpG或暗區(qū)CpG位點的APC比較分析。
結(jié)果顯示，Guppy R10.4和Guppy R9.4在與oxBS數(shù)據(jù)的比較中表現(xiàn)最佳，其平均皮爾遜相關(guān)系數(shù)（APC）最高，分別為0.97845和0.97256。表明Guppy在甲基化檢測上的準(zhǔn)確性最高，能夠最接近oxBS測序的參考標(biāo)準(zhǔn)。研究還分析了不同測序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。所有測序技術(shù)均能準(zhǔn)確復(fù)現(xiàn)oxBS測序觀察到的CpG甲基化率的雙峰分布，Guppy R10.4的分布與oxBS測序結(jié)果最為接近，表明其在極端甲基化狀態(tài)下的檢測更為準(zhǔn)確。
此外，CpG周圍的序列變異會在oxBS中引入比對偏倚，導(dǎo)致甲基化檢測不準(zhǔn)確和APC降低（表1B）。因此對于Guppy和PacBio而言，序列變異周圍CpG位點的重要性較低。所有長讀長測序技術(shù)都使用特定序列背景和與參考基因組的比較來檢測CpG甲基化狀態(tài)，因此可以過濾那些序列變異周圍的CpG位點。
（9）5-mCpG率的分布
研究分析了不同測序技術(shù)在CpG甲基化率分布上的表現(xiàn)。結(jié)果顯示，所有測序技術(shù)在CpG甲基化率的分布上表現(xiàn)出預(yù)期的雙峰分布，但在完全甲基化和完全未甲基化狀態(tài)下的分布略有差異。Guppy R10.4測序結(jié)果與oxBS測序結(jié)果最為接近，而SMRT測序和Guppy R9.4測序結(jié)果則在極端甲基化狀態(tài)下表現(xiàn)出一定的偏倚。這一結(jié)果表明，不同測序技術(shù)在處理低甲基化和中等甲基化狀態(tài)下的CpG位點時可能存在差異，研究者在選擇測序技術(shù)時需要考慮這些因素。
圖3：不同方法檢測CpG甲基化的比較。
A. 在oxBS、Guppy R9.4和R10.4中，CpG甲基化率（0-1）在個體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。B. 在oxBS、PacBio和Nanopore中，CpG甲基化率（0-1）在個體中平均后呈現(xiàn)出oxBS數(shù)據(jù)中預(yù)期的雙峰分布。
C. 全血中表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）的CpG甲基化率在50bp范圍內(nèi)平均值。
D. 每種方法檢測到的CpG位點數(shù)量。Nanopolish統(tǒng)計每個CpG單元的所有CpG位點。
（10）功能區(qū)域的5-mCpG分布
為了研究生物學(xué)背景對甲基化檢測準(zhǔn)確性的作用，研究人員分析了全血中表達(dá)基因的TSS處50bp以內(nèi)的平均5-mCpG率。所有甲基化檢測方法都高度匹配oxBS測序樣本中的甲基化模式，表明在TSS區(qū)域內(nèi)甲基化缺失（圖3C）。其中PacBio和Guppy R9.4在TSS處顯示出更高的CpG甲基化率，而在TSS之外則顯示出低甲基化率，這與這兩種方法的甲基化分布輕微偏移一致（圖3A、B）。而Guppy R10.4測序結(jié)果更接近于oxBS中的TSS甲基化水平（圖3C）。表明其在功能區(qū)域的甲基化檢測上具有高準(zhǔn)確性。這一結(jié)果進(jìn)一步證實了Guppy R10.4測序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用潛力，特別是在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞分化機(jī)制研究中。
（11）長讀長測序比oxBS測序檢測到更多的CpG位點數(shù)量
研究發(fā)現(xiàn)，長讀長測序技術(shù)在檢測CpG位點數(shù)量上優(yōu)于oxBS測序。Nanopore測序和SMRT測序平均每個樣本檢測到約27M CpG位點（Guppy R9.4=27,467,383個CpG位點，Guppy R10.4=27369144個CpG位點，PacBio=26,739,539個CpG位點，Nanopolish=26,487,587個CpG位點，分布在22,058,476個CpG單元中），而oxBS測序僅檢測到約26M CpG位點（圖3D）。這一結(jié)果表明，長讀長測序技術(shù)在CpG甲基化檢測上具有更高的分辨率和更全面的覆蓋范圍，能夠為研究者提供更豐富的表觀遺傳學(xué)信息。這一優(yōu)勢在研究復(fù)雜基因組區(qū)域和稀有甲基化中尤為顯著。
討論和啟示
本研究通過大規(guī)模樣本分析，揭示了長讀長測序技術(shù)在CpG甲基化檢測中的優(yōu)勢和局限性。研究揭示了測序深度、鏈偏倚、序列背景等因素對甲基化檢測的準(zhǔn)確性有顯著影響。同時，長讀長測序技術(shù)在檢測CpG甲基化方面具有顯著優(yōu)勢，尤其是在無需化學(xué)處理DNA的情況下直接檢測甲基化修飾的能力。最新的R10.4芯片技術(shù)，通過降低鏈偏倚和提高檢測準(zhǔn)確性，進(jìn)一步提升了ONT測序在甲基化檢測中的性能。未來的研究可以利用這些技術(shù)優(yōu)勢，深入探索基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化以及疾病發(fā)生機(jī)制等領(lǐng)域的表觀遺傳學(xué)變化。
參考文獻(xiàn)：
Sigurpalsdottir, B.D., Stefansson, O.A., Holley, G. et al. A comparison of methods for detecting DNA methylation from long-read sequencing of human genomes. Genome Biol 25, 69 (2024). Doi：10.1186/s13059-024-03207-9
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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