基于SoloVPE系統(tǒng)的斜率光譜法在加速ASO藥物含量測(cè)定中的優(yōu)勢(shì)

你是否聽說過這樣一種療法：通過設(shè)計(jì)一段短小的DNA序列，就能精準(zhǔn)地“關(guān)閉”致病基因，或者讓基因“跳過”有問題的部分，恢復(fù)正常功能？這聽起來像是科幻小說，但實(shí)際上，這已經(jīng)是現(xiàn)實(shí)——這就是反義寡核苷酸（ASO）藥物。

ASO是人工合成的短鏈單鏈脫氧核苷酸序列，長(zhǎng)度通常在13-30個(gè)核苷酸之間。它們能夠通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)mRNA結(jié)合，在基因表達(dá)水平上發(fā)揮藥效。

截至目前，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)了10種ASO藥物，為多種罕見病和難治性疾病帶來了新的希望。

表1. FDA批準(zhǔn)的ASO藥物

對(duì)于ASO藥物而言，原料藥的含量測(cè)定是關(guān)鍵質(zhì)量屬性，直接影響藥物的安全性和有效性。因此，在藥品生產(chǎn)的不同單元操作中，必須實(shí)施適當(dāng)?shù)倪^程控制測(cè)量，確保ASO含量始終在可接受范圍內(nèi)。

來自Ionis Pharmaceuticals和C Technologies公司的研究人員在《BioProcess International》上發(fā)表的一項(xiàng)研究，為我們展示了一種全新的解決方案——基于SoloVPE系統(tǒng)的斜率光譜法。這種方法不僅能提供與HPLC相當(dāng)?shù)姆治鼋Y(jié)果，還能將檢測(cè)時(shí)間縮短67%。

SoloVPE斜率光譜法：原理揭秘
基于以下由Beer-Lambert法則推導(dǎo)的斜率光譜方程：

其中，m為在給定波長(zhǎng)條件下、以不同光程條件下的吸光度繪制的回歸線的斜率，ℇ為消光系數(shù)，c為樣品濃度。本文使用已知濃度的ASO參考標(biāo)準(zhǔn)溶液，以消除預(yù)先確定ASO的ℇ值的需要。在這種情況下，可以使用以下公式計(jì)算樣品濃度：

其中cStandard和cSample分別為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的濃度，mStandard和mSample分別為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在260 nm處的斜率。被測(cè)樣品濃度以API純度因子進(jìn)一步調(diào)整，作為最終測(cè)定值報(bào)告。

圖1. SoloVPE檢測(cè)原理

SoloVPE斜率光譜法優(yōu)勢(shì)：效率提升
SoloVPE系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)更短的周轉(zhuǎn)時(shí)間、簡(jiǎn)化的測(cè)試程序，從而顯著提高過程控制效率。

表2. SoloVPE和HPLC方法對(duì)比

數(shù)據(jù)說話：方法驗(yàn)證結(jié)果

研究團(tuán)隊(duì)對(duì)多種不同化學(xué)修飾的ASO進(jìn)行了廣泛測(cè)試，包括堿基修飾、糖修飾、核苷間連接修飾以及GalNAc偶聯(lián)物等。

重復(fù)性和準(zhǔn)確性
圖2為5種代表性ASO在不同緩沖液中的測(cè)試結(jié)果：斜率RSD≤0.2%（n=3），重復(fù)性良好；含量回收率98.0% - 102.0%（預(yù)期值為L(zhǎng)C-UV-MS檢測(cè)結(jié)果），準(zhǔn)確性良好。

圖2. 重復(fù)性和準(zhǔn)確性結(jié)果

中間精密度
圖3為兩位分析人員在三個(gè)不同測(cè)試日對(duì)ASO_B進(jìn)行測(cè)量，無論是日內(nèi)RSD還是總體RSD均< 1.0%，展現(xiàn)出優(yōu)異的中間精密度。

圖3. 中間精密度結(jié)果

線性
在目標(biāo)濃度的50%至150%范圍內(nèi)，ASO_B和ASO_D的線性回歸擬合度R²均達(dá)到了0.9999，線性良好（圖4）。

圖4. 線性結(jié)果

耐用性
圖5顯示，除打開樣品蓋外，所有測(cè)試條件均通過了耐用性測(cè)試。打開樣品蓋導(dǎo)致的問題可通過重新蓋上蓋子測(cè)量輕松解決。

圖5. 耐用性結(jié)果

重現(xiàn)性
該方法已成功轉(zhuǎn)移至CMO，并在GMP藥品生產(chǎn)中實(shí)施。圖6顯示，四種不同ASO的內(nèi)部檢測(cè)結(jié)果與CMO結(jié)果的含量回收率差異均< 2.0%，證實(shí)了方法的良好重現(xiàn)性。

圖6. 重現(xiàn)性結(jié)果

結(jié)論
研究表明，SoloVPE系統(tǒng)的斜率光譜法對(duì)于化學(xué)修飾的ASO藥物來說，是一種準(zhǔn)確、精密、耐用且符合ICH Q2（R1）驗(yàn)證要求的方法。該方法可在多個(gè)場(chǎng)地普遍實(shí)施，并在產(chǎn)品轉(zhuǎn)移過程中獲得一致的結(jié)果。

與HPLC相比，該方法提供了相同水平的準(zhǔn)確度和精密度，但時(shí)間節(jié)省顯著——這使其成為ASO藥物生產(chǎn)中更高效、更通用的過程控制檢測(cè)方法。

隨著ASO藥物研發(fā)管線日益豐富，這種高效的檢測(cè)方法無疑將為制藥企業(yè)加快產(chǎn)品上市、確保產(chǎn)品質(zhì)量提供有力支持。