Arrayjet生物芯片點(diǎn)樣儀助力適配體小分子靶點(diǎn)的高通量篩選

瀏覽次數(shù)：584　發(fā)布日期：2026-1-30　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

RNA適配體與小分子染料結(jié)合后會顯著增強(qiáng)熒光，提高信噪比，在RNA成像領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。目前已開發(fā)出多種熒光RNA適配體，包括Spinach、Broccoli、Mango、Corn、Pepper等。通常情況下，這些適配體可結(jié)合多種小分子染料，應(yīng)用于細(xì)胞成像研究，包括多色RNA成像、單分子光譜分析以及構(gòu)建檢測傳感器。

Mango RNA適配體是一種高親和力的核糖核苷酸適配體，這種適配體以納摩爾親和力結(jié)合一種噻唑橙熒光團(tuán)衍生物(TO1-biotin)，使熒光強(qiáng)度提高數(shù)倍。Mango RNA適配體由39個(gè)核苷酸組成，相對于其他熒光適配體其堿基長度較短，可輕易進(jìn)行設(shè)計(jì)和編碼改造。X射線晶體結(jié)構(gòu)研究表明，這類適配體可折疊成含G - 四鏈體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，通過將TO熒光團(tuán)限制在平面構(gòu)象中實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng)。

RNA常作為小分子的重要靶點(diǎn)，但開發(fā)高效、高選擇性的RNA小分子配體仍十分困難。片段導(dǎo)向設(shè)計(jì)是一種常用的研究方法，該方法從親和力弱但特異性強(qiáng)的低分子量配體出發(fā)，快速開發(fā)出靶向目標(biāo)的高親和力、高特異性小分子結(jié)合劑。

本文通過片段導(dǎo)向微陣列篩選技術(shù)，以結(jié)構(gòu)為導(dǎo)向發(fā)現(xiàn)了新一代 Mango II RNA適配體TO衍生熒光團(tuán)。通過對Mango II–TO 結(jié)合口袋進(jìn)行計(jì)算分析，識別了疏水區(qū)域、口袋體積及適合小分子結(jié)合的區(qū)域，進(jìn)而將TO與特定小分子連接，合成出多種新型染料，其中一種（SALAD1）表現(xiàn)出亞納摩爾級親和力，且熒光強(qiáng)度比TO1–biotin高出3.5倍。

文章題目為“Structure-informed design of an ultrabright RNA-activated fluorophore”于2025年5月發(fā)表在Nature chemistry雜志，研究團(tuán)隊(duì)來自美國國家癌癥研究所。

作者開發(fā)了一種獨(dú)特的TO衍生熒光團(tuán)，分析Mango適配體內(nèi)部的配體結(jié)合口袋，并定性對比及MolSoft Pocketfinder 軟件分析，研究Mango適配體中TO1類配體的結(jié)合模式（圖1a），實(shí)現(xiàn)結(jié)合該適配體小分子的高通量篩選。

通過對 TO1-Mango II 復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)分析，顯示該配體結(jié)合口袋具有疏水性，且體積適合識別小分子配體。TO1 - 生物素與適配體結(jié)合時(shí)，會堆疊在鳥嘌呤四聯(lián)體上并與 A12、A17 相互作用，而生物素側(cè)鏈暴露于溶劑中，在晶體結(jié)構(gòu)中未被解析。將不含生物素側(cè)鏈的TO結(jié)構(gòu)對接至Mango II適配體后，作者發(fā)現(xiàn)在口袋內(nèi)存在一個(gè)空位。推測該空位可容納一個(gè)獨(dú)立片段分子，該分子可通過 TO上的甲基連接，進(jìn)而有望改善結(jié)合效果（圖1b）。

為高效篩選 TO 的共結(jié)合片段，作者開發(fā)了小分子微陣列（SMM），基于存在或不存在TO 配體的條件下篩選帶標(biāo)簽的Mango適配體（圖1c）。2214 個(gè)小分子片段均含有伯胺和羥基，可通過英國Arrayjet生物芯片點(diǎn)樣儀將其固定到異氰酸酯修飾的載玻片上，形成SMM。

同時(shí)，帶有多聚腺苷酸（polyA）尾的 Mango RNA用 Cy5 進(jìn)行標(biāo)記，與玻片進(jìn)行孵育，觀察存在TO以及不存在TO情況下的結(jié)合效果，并對每個(gè)斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。Mango II 組與 Mango II+TO篩選結(jié)果的皮爾遜相關(guān)系數(shù)僅為 0.04，表明有無 TO 存在時(shí)，篩選得到的陽性化合物集合存在顯著差異（圖1d）。

共鑒定出30個(gè)片段（F1-F30）為 Mango II RNA 的結(jié)合陽性片段分子。其中11個(gè)分子與TO的結(jié)合無競爭性，其余19個(gè)為競爭性結(jié)合。作者推測部分非競爭性陽性分子可能結(jié)合于Mango適配體的可用口袋中（圖1b）。

圖 1 | Mango 適配體的結(jié)構(gòu)及片段結(jié)合特征a. TO 與 TO1 - 生物素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。b. 存在 TO 時(shí)，Mango II RNA 適配體的口袋模型分析。c. 基于片段微陣列（SMM）的篩選流程：使用 Cy5 標(biāo)記的 Mango II RNA（250 nM），基于存在或不存在競爭性配體 TO（2.5 µM）的條件下進(jìn)行篩選。每個(gè)樣品均開展重復(fù)篩選。d. 不同孵育條件下（Mango II 組 vs Mango II+TO 組）各片段的 Z 值對比（Z 值閾值 = 3）。紅線代表皮爾遜相關(guān)性擬合結(jié)果。藍(lán)色圓點(diǎn)代表與 TO 呈競爭性結(jié)合的片段，紅色圓點(diǎn)代表非競爭性結(jié)合片段。

針對小分子微陣列篩選中發(fā)現(xiàn)的11個(gè)與TO呈非競爭性結(jié)合的片段，作者探究了這些分子是否會影響配體所發(fā)出的熒光。通過向 TO-Mango II 復(fù)合物溶液中滴定小分子溶液進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定實(shí)驗(yàn)。滴定在500 nM TO下進(jìn)行，確保 Mango II口袋的結(jié)合達(dá)到完全飽和，記錄熒光強(qiáng)度隨片段濃度的變化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)非競爭性片段（F1-F3、F5-F6、F10）能不同程度地增強(qiáng) TO 熒光（增幅為 5% 至 116%），其余5個(gè)片段效果微弱或無明顯作用（圖2a）。值得注意的是，3 個(gè)具有熒光增強(qiáng)作用的片段（F1-F3）含有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

此外，作者還測試了競爭性結(jié)合片段（包括3個(gè)代表性片段 F28-F30 以及2種已知的 G - 四鏈體（G4）堆疊配體 BRACO19 和 PhenDC3），它們在熒光實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出競爭性結(jié)合特征。在所有片段中，F(xiàn)2（圖2b）展現(xiàn)出最具潛力的熒光增強(qiáng)效果，其半數(shù)有效濃度（EC50）為 52±19 µM，熒光強(qiáng)度提升 95%，且 Z 值較高（圖 2c）。

因此，作者選擇F2進(jìn)行后續(xù)研究。F2本身無熒光，這表明F2片段的結(jié)合是通過增強(qiáng)TO自身的熒光發(fā)揮作用。結(jié)果不僅驗(yàn)證了小分子微陣列篩選非競爭性配體的有效性，還首次發(fā)現(xiàn)非競爭性、非共價(jià)結(jié)合的配體能夠增強(qiáng)TO的熒光。

隨后作者通過多種方法表征了F2與TO-Mango II 復(fù)合物的結(jié)合情況。表面等離子體共振（SPR）實(shí)驗(yàn)中，將帶有多聚腺苷酸（polyA）尾的 Mango II RNA 固定在鏈霉親和素芯片表面（圖2d）。分別給與500 µM F2 或1 µM TO 時(shí)，結(jié)合信號分別為 10±1 和 41±2 響應(yīng)單位（RU）。同時(shí)給與TO 和 F2 時(shí)，觀察到的結(jié)合水平為 52±4 RU，大致相當(dāng)于單個(gè)組分結(jié)合響應(yīng)的總和（圖 2e），這證實(shí)了兩者可同時(shí)結(jié)合。將 F2 滴定數(shù)據(jù)擬合至結(jié)合等溫線，得到解離常數(shù)（KD）為 700±260 µM。平行實(shí)驗(yàn)中，樣品先與飽和濃度（500 nM）的 TO 預(yù)平衡，再進(jìn)行F2 滴定。

結(jié)果顯示，TO存在時(shí)，F(xiàn)2的解離常數(shù)無顯著變化（KD=450±120 µM），表明TO與RNA 的結(jié)合不會顯著影響F2的結(jié)合。此外，熒光滴定實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，F(xiàn)2 的結(jié)合不會改變TO與適配體的KD值。除此之外，還通過核磁共振（NMR）評估了F2的結(jié)合情況。配體峰的正相位信號表明存在結(jié)合相互作用（圖 2f ）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)2 僅在TO存在時(shí)與 Mango II RNA 結(jié)合。相反，缺失任一組分（TO 或 RNA）時(shí)，NMR 光譜呈現(xiàn)負(fù)相位，表明無相互作用發(fā)生。綜上，這些結(jié)果證實(shí)F2占據(jù)的 RNA 結(jié)合位點(diǎn)與 TO 的結(jié)合位點(diǎn)不同。

圖 2 | 與 TO 共結(jié)合 RNA 的片段鑒定a. 熒光強(qiáng)度測定實(shí)驗(yàn)（激發(fā)波長 λex=510 nm；發(fā)射波長 λem=535 nm）：使用微陣列篩選發(fā)現(xiàn)的代表性非競爭性片段（F1-F3、F5、F6、F10）和競爭性片段（F28-F30）。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±s.d.）表示，基于三次技術(shù)重復(fù)（n=3）。經(jīng)典 G - 四鏈體（G4）結(jié)合劑 BRACO19 和 PhenDC3 用作實(shí)驗(yàn)的對照。在飽和濃度（500 nM）TO 存在下，向 Mango II RNA 中滴定片段。Mango II-TO 復(fù)合物的初始熒光強(qiáng)度被歸一化為 1。片段滴定結(jié)果顯示出熒光增強(qiáng)或淬滅效應(yīng)。b、c. F2 的化學(xué)結(jié)構(gòu)（b）及小分子微陣列（SMM）篩選結(jié)果（Z 值及斑點(diǎn)圖像；c）。d. 分別針對 TO、F2 及 TO+F2 混合溶液的表面等離子體共振（SPR）結(jié)合實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣品均進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得SPR結(jié)果圖。e. SPR 結(jié)合定量分析。SPR 數(shù)據(jù)來自三次技術(shù)重復(fù)進(jìn)樣（n=3），柱狀圖數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±s.d.）表示。f. 水配體觀察梯度光譜（waterLOGSY）核磁共振（NMR）實(shí)驗(yàn)：驗(yàn)證有無 TO 存在時(shí) F2 與 Mango II RNA 的結(jié)合情況。N - 甲基纈氨酸（N–Me–Val–OH）用作非結(jié)合內(nèi)參對照以作比較。

該研究表明，通過小分子微陣列技術(shù)，可開發(fā)出性能更優(yōu)的RNA 結(jié)合配體。作者發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能與TO非競爭性結(jié)合Mango II 并增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度的分子。將該分子與TO共價(jià)連接后，所得染料對適配體的親和力達(dá)到亞納摩爾級別。

SALAD1以獨(dú)特方式結(jié)合Mango II，其特征是通過改變A22的構(gòu)象形成更封閉的結(jié)合位點(diǎn)。該結(jié)合構(gòu)象使羰基氧處于與鉀離子成鍵的距離范圍內(nèi)，而該鉀離子可穩(wěn)定相鄰鳥嘌呤四聯(lián)體（G4）的中心。小分子配體能夠?qū)⒛硞€(gè)基團(tuán)定位在 G4 鉀離子的成鍵距離內(nèi)，這種獨(dú)特的結(jié)合相互作用可能為其他G4配體的設(shè)計(jì)提供啟發(fā)。

SALAD1的獨(dú)特性能及其特定分子相互作用，最終催生了一類亮度更高、實(shí)用性更強(qiáng)的 RNA 激活型熒光團(tuán)。由于熒光亮度高且背景信號低，“Mango-SALAD” 系統(tǒng)非常適合共聚焦成像，有望為 RNA 表達(dá)與定位研究創(chuàng)造新的機(jī)會。本文所述的設(shè)計(jì)策略不僅對改良型成像探針（包括其他熒光激活 RNA 適配體）的開發(fā)具有指導(dǎo)意義，也為藥物化學(xué)領(lǐng)域開發(fā)與治療相關(guān) RNA 相互作用的生物活性化合物提供了參考。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41557-025-01832-w

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