腦-骨軸調(diào)控新機(jī)制的研究：WDFY1 介導(dǎo)神經(jīng)元誘導(dǎo)骨丟失

2026年1月5日，中南大學(xué)謝輝、饒珊珊、陳春媛共同通訊在Nature Aging（IF=19.5）在線發(fā)表題為“Brain neuron-derived WDFY1 induces bone loss”的研究論文。文中提到大腦健康與骨骼穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，骨骼衰老的特征是骨形成不足和骨髓脂肪堆積，但大腦是否會導(dǎo)致這種失衡尚不明確。此前研究雖發(fā)現(xiàn)腦源性因素參與骨重塑，且精神或神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者更易患骨質(zhì)疏松，但自然衰老的大腦是否通過腦 - 骨軸調(diào)控，參與破壞骨微環(huán)境、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）異常向脂肪細(xì)胞分化，進(jìn)而引發(fā)骨質(zhì)疏松，仍缺乏相關(guān)證據(jù)。

基于此，本研究旨在探究以下核心問題：一是衰老大腦來源的細(xì)胞外囊泡（AB-EVs）是否會對骨骼代謝產(chǎn)生影響，引發(fā)骨 - 脂肪失衡；二是若存在上述影響，AB-EVs 中發(fā)揮關(guān)鍵作用的功能因子是什么；三是該功能因子調(diào)控骨骼代謝的具體分子機(jī)制；四是通過干預(yù)該調(diào)控通路，能否改善年齡相關(guān)的骨流失和骨質(zhì)疏松，為臨床防治骨骼衰老相關(guān)疾病提供新靶點(diǎn)和新思路。

1、研究方法
1 細(xì)胞外囊泡（EVs）的分離與鑒定
從不同年齡和基因型小鼠的腦組織中分離年輕大腦來源 EVs（YB-EVs）、衰老大腦來源 EVs（AB-EVs）及對應(yīng)非 EV 組分，通過透射電子顯微鏡觀察形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析（NTA）檢測粒徑和濃度，Western blotting 驗證 CD9、CD63 等外泌體標(biāo)志物的表達(dá)，排除非 EV 蛋白污染。同時，從老年和年輕人類供體血漿中分離血漿 EVs（Pla-EVs），用于后續(xù)功能驗證。

2 動物模型構(gòu)建與處理
構(gòu)建多種基因工程小鼠模型，包括 Wdfy1 條件性敲除小鼠（Wdfy1fl/fl）、Rab27b 條件性敲除小鼠（Rab27bfl/fl），并與 Map2-CreERT2 或 Camk2a-CreERT2 小鼠雜交，獲得神經(jīng)元特異性敲除 Wdfy1 或 Rab27b 的小鼠；構(gòu)建 Tlr3-/- 和 Tlr4-/- 小鼠，用于探究信號通路依賴性。通過腦室內(nèi)注射、海馬注射、靜脈注射等方式，給予小鼠 AAV 載體（過表達(dá)或沉默 Wdfy1）、EVs、重組 WDFY1 蛋白或 RVG-9R 介導(dǎo)的 siWdfy1 等干預(yù)，設(shè)置不同性別和年齡組，持續(xù)干預(yù)后檢測骨骼相關(guān)表型。

3 細(xì)胞實驗
分離小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）和 RAW264.7 破骨前體細(xì)胞，進(jìn)行成骨分化、成脂分化和破骨分化誘導(dǎo)。通過 Alizarin Red S（ARS）染色檢測成骨鈣結(jié)節(jié)形成，Oil Red O（ORO）染色檢測成脂脂質(zhì)積累，TRAP 染色鑒定破骨細(xì)胞。利用 siRNA 沉默目標(biāo)基因（如 Vps29、Vps26a、Ctsd 等），或轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，探究分子機(jī)制。

4 檢測與分析技術(shù)
采用 microcomputed tomography（μCT）分析骨骼微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)（如骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量等）；三點(diǎn)彎曲試驗檢測股骨力學(xué)強(qiáng)度；免疫染色（OCN、perilipin 等）檢測成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞數(shù)量；qRT-PCR 檢測成骨、成脂相關(guān)基因表達(dá)；ELISA 檢測血清中骨代謝標(biāo)志物（OCN、CTX-I）、炎癥因子及 WDFY1 蛋白水平；蛋白質(zhì)組學(xué)分析 EVs 中差異表達(dá)蛋白；免疫共沉淀（Co-IP）和 pull-down 實驗驗證蛋白相互作用；免疫熒光染色觀察蛋白定位與共定位。

5 生物信息學(xué)分析
重新分析公共單細(xì)胞 RNA 測序（snRNA-seq）數(shù)據(jù)集，鑒定大腦中 Wdfy1 高表達(dá)的細(xì)胞類型，量化不同年齡組中 Wdfy1 陽性細(xì)胞比例。

2、研究內(nèi)容
1 AB-EVs 誘導(dǎo)骨 - 脂肪失衡并改變 BMSC 分化命運(yùn)
透射電子顯微鏡下，YB-EVs 與 AB-EVs 均呈現(xiàn)典型的球形或杯狀結(jié)構(gòu)，納米顆粒追蹤分析檢測二者粒徑相近，且均表達(dá)外泌體特征標(biāo)志物。經(jīng) DIR 標(biāo)記的 EVs 經(jīng)腦室內(nèi)或靜脈注射后，可在小鼠骨骼等多個器官檢測到熒光信號；Map2-CreERT2; Cd63 報告小鼠實驗證實，生理條件下神經(jīng)元來源的 EVs 可進(jìn)入骨骼組織。4 月齡年輕小鼠經(jīng)靜脈注射 AB-EVs 后，骨小梁相關(guān)骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)顯著降低，股骨力學(xué)強(qiáng)度下降，成骨細(xì)胞數(shù)量減少，骨髓脂肪細(xì)胞增多，破骨細(xì)胞的數(shù)量與活性均顯著增強(qiáng)；15 月齡老年小鼠注射 AB-EVs 后，骨流失與骨髓脂肪堆積的表型進(jìn)一步加重。體外實驗結(jié)果顯示，AB-EVs 可顯著抑制 BMSCs 的成骨分化、促進(jìn)其成脂分化，人類老年血漿來源的 EVs 也呈現(xiàn)出一致的調(diào)控效應(yīng)。

圖1 | AB-EVs誘導(dǎo)骨-脂肪失衡并改變 BMSC 分化命運(yùn)。

2 WDFY1 是 AB-EVs 中調(diào)控骨代謝的關(guān)鍵蛋白
蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，AB-EVs 與 YB-EVs 存在多種差異表達(dá)蛋白，其中 WDFY1 在 AB-EVs 中呈顯著上調(diào)趨勢。qRT-PCR 與 Western blotting 實驗證實，老年小鼠大腦組織中 Wdfy1 的 mRNA 與蛋白表達(dá)水平均顯著升高，且骨髓組織中 WDFY1 蛋白表達(dá)也同步升高，提示骨髓中的 WDFY1 可能由大腦轉(zhuǎn)運(yùn)而來。體外實驗顯示，重組 WDFY1 蛋白可直接抑制 BMSCs 成骨分化、促進(jìn)其成脂分化，下調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)，上調(diào)成脂相關(guān)基因表達(dá)，且對破骨細(xì)胞分化存在劑量依賴性調(diào)控作用。ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)，老年小鼠的血清及血清 EVs 中 WDFY1 水平均顯著升高，人類老年血漿及血漿 EVs 中 WDFY1 表達(dá)水平隨年齡增長呈上升趨勢，且與骨密度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
 

圖2 | 抗成骨與促脂肪生成蛋白WDFY1在AB-EVs中富集，且與骨密度（BMD）呈負(fù)相

3 大腦 WDFY1 通過 EVs 介導(dǎo)調(diào)控骨 - 脂肪失衡
年輕小鼠經(jīng)腦室內(nèi)注射 AAV2-Wdfy1 過表達(dá)載體后，出現(xiàn)骨量減少、骨力學(xué)強(qiáng)度下降，成骨細(xì)胞減少、脂肪細(xì)胞增多，且組織中炎癥因子水平升高的表型；而老年小鼠經(jīng)腦室內(nèi)注射 AAV2-shWdfy1 沉默載體后，骨骼的衰老相關(guān)表型得到顯著改善。從 Wdfy1 沉默小鼠中分離的 AB-EVs，其 WDFY1 蛋白含量顯著降低，對 BMSCs 成骨、成脂分化的調(diào)控作用也隨之減弱。直接向小鼠骨髓內(nèi)注射 WDFY1 蛋白，或靜脈注射過表達(dá) Wdfy1 小鼠的血清 EVs，均可誘導(dǎo)年輕小鼠出現(xiàn)骨流失與骨髓脂肪堆積的表型。在小鼠海馬部位注射 Wdfy1 過表達(dá)或沉默載體，也觀察到相似的骨骼表型改變，證實大腦（尤其是海馬區(qū)）來源的 WDFY1 可通過 EVs 轉(zhuǎn)運(yùn)至骨骼，進(jìn)而調(diào)控骨代謝與骨 - 脂肪平衡。
 

圖3 | WDFY1基因在腦部促進(jìn)骨-脂肪失衡并介導(dǎo)AB-EVs對 BMSC 分化的影響

4 神經(jīng)元 Wdfy1 缺失或抑制神經(jīng)元 EV 釋放改善骨骼衰老
單細(xì)胞核 RNA 測序與免疫熒光染色實驗證實，WDFY1 主要在老年小鼠大腦的 MAP2 陽性神經(jīng)元中高表達(dá)，其中海馬與大腦皮層的 CAMK2A 陽性神經(jīng)元為主要表達(dá)部位。構(gòu)建神經(jīng)元特異性 Wdfy1 敲除小鼠（Map2-CreERT2; Wdfy1fl/fl、Camk2a-CreERT2; Wdfy1fl/fl）后發(fā)現(xiàn)，老年敲除小鼠的骨量與骨力學(xué)強(qiáng)度顯著提升，成骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨髓脂肪細(xì)胞減少，組織中炎癥因子水平降低。構(gòu)建神經(jīng)元特異性 Rab27b 敲除小鼠以抑制神經(jīng)元 EV 的釋放，結(jié)果顯示其 AB-EV 的產(chǎn)量減少，且 EVs 中 WDFY1 含量降低，小鼠骨骼的衰老相關(guān)表型得到顯著改善，其 AB-EVs 對 BMSCs 成骨、成脂分化的調(diào)控作用也相應(yīng)減弱。

圖4 | 神經(jīng)元Wdfy1缺失或阻斷神經(jīng)元EV分泌可增加骨量并緩解衰老誘導(dǎo)的骨-脂肪失衡。

5 RVG 介導(dǎo)的腦內(nèi) siWdfy1 遞送改善老年小鼠骨骼健康
利用可穿越血腦屏障并靶向神經(jīng)元的 RVG-9R 肽遞送 siWdfy1，對老年小鼠進(jìn)行靜脈注射處理后，其海馬神經(jīng)元中 WDFY1 的表達(dá)被顯著抑制，且 RVG-9R-siWdfy1 的抑制效果優(yōu)于對照肽。骨微結(jié)構(gòu)檢測與力學(xué)測試結(jié)果顯示，RVG-9R-siWdfy1 處理組小鼠的骨量與骨強(qiáng)度顯著升高，成骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨髓脂肪細(xì)胞減少，其 AB-EVs 對 BMSCs 的成骨抑制與成脂促進(jìn)作用也明顯減弱。
 

圖5 | RVG 介導(dǎo)的siWdfy1腦部遞送可改善老年小鼠骨骼健康。

6 WDFY1 通過 retromer 復(fù)合體調(diào)控 CTSD 和 PRDX2 回收
蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫共沉淀實驗證實，WDFY1 可與 retromer 復(fù)合體的核心組分直接結(jié)合。利用 siRNA 沉默 retromer 復(fù)合體相關(guān)基因后，WDFY1 對 BMSCs 成骨、成脂分化的調(diào)控作用被顯著抑制。WDFY1 的 WD 結(jié)構(gòu)域缺失突變體喪失了對 BMSC 分化的調(diào)控功能，而 FYVE 結(jié)構(gòu)域缺失則對其調(diào)控功能無明顯影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WDFY1 對 Ctsd 和 Prdx2 的基因表達(dá)無明顯調(diào)控作用，但可通過結(jié)合 retromer 復(fù)合體，促進(jìn)二者從內(nèi)體向高爾基體的回收過程，減少其降解，進(jìn)而導(dǎo)致兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累。利用 siRNA 分別沉默 Ctsd 或 Prdx2 后，可分別削弱 WDFY1 對 BMSCs 的成脂促進(jìn)或成骨抑制作用。免疫共沉淀實驗顯示，CTSD 可與 retromer 復(fù)合體的多種組分結(jié)合，PRDX2 也可與 retromer 復(fù)合體的特定組分結(jié)合。

圖6 | 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體VPS26A/B-VPS35-VPS29介導(dǎo)WDFY1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的調(diào)控作用。

7 WDFY1 的骨損傷作用不依賴 TLR3/4 信號
在 Tlr3 基因敲除與 Tlr4 基因敲除小鼠中，經(jīng)腦室內(nèi)注射 AAV2-Wdfy1 過表達(dá)載體后，小鼠骨量相關(guān)指標(biāo)仍呈顯著降低趨勢，表明 WDFY1 對骨代謝的調(diào)控作用獨(dú)立于 TLR3/4 信號通路。

3、創(chuàng)新點(diǎn)
1 揭示衰老大腦神經(jīng)元 EVs 介導(dǎo)的腦 - 骨調(diào)控新通路
首次證實衰老大腦神經(jīng)元分泌的 EVs 是腦 - 骨軸的關(guān)鍵信使，與年輕大腦 EVs 不同，AB-EVs 可通過轉(zhuǎn)運(yùn) WDFY1 蛋白，遠(yuǎn)程調(diào)控骨骼代謝，誘導(dǎo)骨 - 脂肪失衡和骨質(zhì)疏松，明確了大腦衰老在骨骼衰老中的主動調(diào)控作用，突破了傳統(tǒng)對腦 - 骨通信方式的認(rèn)知。

2 鑒定 WDFY1 為骨代謝新調(diào)控因子
發(fā)現(xiàn) WDFY1 作為此前未被報道的骨代謝調(diào)控蛋白，在衰老大腦神經(jīng)元中高表達(dá)，通過 EVs 轉(zhuǎn)運(yùn)至骨髓后，發(fā)揮抗成骨、促成脂作用，且其在人類血漿和血漿 EVs 中的水平與骨密度呈負(fù)相關(guān)，為骨質(zhì)疏松的診斷提供了潛在生物標(biāo)志物。

4、啟發(fā)
1 深化腦 - 骨軸研究認(rèn)知
該研究證實大腦衰老并非被動過程，而是通過 EVs 介導(dǎo)的遠(yuǎn)程調(diào)控主動參與骨骼衰老，提示在研究骨質(zhì)疏松等年齡相關(guān)骨骼疾病時，需充分考慮大腦狀態(tài)的影響，為從多器官交互角度理解骨骼代謝調(diào)控提供了新視角，未來可進(jìn)一步探索腦 - 骨軸中其他 EVs cargo 的作用。

2 拓展生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)范圍
WDFY1 作為與骨密度負(fù)相關(guān)的蛋白，有望開發(fā)為骨質(zhì)疏松的診斷生物標(biāo)志物，尤其適用于老年人群或伴有腦功能衰退的患者。同時，WDFY1、retromer 復(fù)合體組分或 CTSD/PRDX2 均可作為骨質(zhì)疏松治療的潛在靶點(diǎn)，為研發(fā)新型抗骨質(zhì)疏松藥物提供了明確方向。

參考文獻(xiàn)：Chen CY, Wang Z, Hong CG, Tan YJ, Duan YX, Luo Y, Wang X, Zeng HJ, Luo JY, Wan TF, Yin H, Liu XX, Zhu H, Zhou Y, Wang ZG, He ZH, Hu XY, Hu GW, Lang HL, Wang ZX, Cao J, Rao SS, Xie H. Brain neuron-derived WDFY1 induces bone loss. Nat Aging. 2026 Jan 5. doi: 10.1038/s43587-025-01032-8IF: 19.4 Q1 . Epub ahead of print. PMID: 41491871.

創(chuàng)作聲明：本文是在原英文文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行解讀，存在觀點(diǎn)偏向性，僅作分享，請參考原文深入學(xué)習(xí)。

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