調(diào)控慢性瘙癢新靶點(diǎn)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞大麻素2型受體（CB₂R）的研究

01 研究背景與臨床意義
慢性瘙癢是由皮膚疾病（如過(guò)敏性、接觸性皮炎）、系統(tǒng)性疾病（如腎臟、肝臟疾�。┘吧窠�(jīng)性疾病等因素誘發(fā)或特發(fā)性的一種頑固性病癥。在普通人群中發(fā)病率高達(dá)20%，且隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)病率持續(xù)增高，嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康。臨床治療瘙癢多數(shù)情況下依賴(lài)于抗組胺類(lèi)藥劑，但其對(duì)于慢性瘙癢療效有限。

近年來(lái)，針對(duì)外周炎癥介質(zhì)的新型生物制劑（如IL-4Rα/IL-13單克隆抗體）在緩解慢性瘙癢方面展現(xiàn)出一定潛力，但這類(lèi)藥物仍存在明顯局限性：一方面其適應(yīng)癥范圍較為局限，另一方面與傳統(tǒng)的免疫抑制藥物（包括環(huán)孢素、甲氨蝶呤等）相似，可能引發(fā)免疫系統(tǒng)功能抑制或嚴(yán)重的超敏反應(yīng)等不良反應(yīng)。因此，臨床針對(duì)慢性瘙癢的治療手段仍然有限且普遍療效欠佳，主要源于其病因復(fù)雜以及我們對(duì)于其病理慢性化的潛在機(jī)制認(rèn)知有限。近年研究發(fā)現(xiàn)，脊髓水平的神經(jīng)免疫交互在感覺(jué)系統(tǒng)疾病中起關(guān)鍵作用，但相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞在慢性瘙癢中的具體調(diào)控機(jī)制尚未明確。

南方科技大學(xué)王子龍團(tuán)隊(duì)在Cell Reports發(fā)表題為：Cannabinoid  CB₂ receptor controls chronic itch by regulating spinal microglial activation and synaptic transmission 的重要研究成果，揭示了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的大麻素2型受體( CB₂R)通過(guò)抑制STAT1/p38炎癥信號(hào)通路和調(diào)控GRP/GRPR神經(jīng)元突觸傳遞機(jī)制，為慢性的精準(zhǔn)治療提供了可靠的藥物研發(fā)靶點(diǎn)及干預(yù)策略。

02 核心發(fā)現(xiàn)與機(jī)制解析
1. CB₂R激活顯著緩解小鼠的慢性瘙癢癥狀
2,4-二硝基氟苯（DNFB）是常用于誘導(dǎo)過(guò)敏性接觸性皮炎的藥物，作者使用該藥物誘導(dǎo)建立小鼠過(guò)敏性接觸性皮炎（ACD）模型，鞘內(nèi)注射 CB₂R選擇性激動(dòng)劑AM1241和GW405833, 顯著減少了WT小鼠的自發(fā)抓撓次數(shù)，且抑制了機(jī)械敏感性瘙癢反應(yīng)。對(duì)應(yīng)的， CB₂R基因敲除（CB₂R-/-）小鼠瘙癢明顯加劇，且AM1241的止癢作用在該小鼠中消失。此外，AM1241的止癢作用也可被 CB₂R拮抗劑AM630阻斷，證實(shí)其作用依賴(lài)于CB₂R。

此外在咪喹莫特（IMQ）誘導(dǎo)的銀屑病模型中，AM1241和GW405833處理也顯著減少了慢性瘙癢；但在組胺、氯喹或化合物48/80誘導(dǎo)的急性瘙癢中，AM1241和GW405833處理未有明顯差異，表明脊髓 CB₂R與慢性瘙癢密切相關(guān)。

圖1.脊髓CB₂R激活顯著抑制 DNFB 誘導(dǎo)的慢性瘙癢

2. 小膠質(zhì)細(xì)胞是 CB₂R介導(dǎo)止癢效應(yīng)的關(guān)鍵執(zhí)行者
作者使用小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物IBA1和 CB₂R mRNA（Cnr2）共定位，結(jié)果表明Cnr2主要表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞中且DNFB模型中Cnr2+小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，RT-qPCR也驗(yàn)證了這一結(jié)果。此外，培養(yǎng)的原代CX3CR1-GFP新生幼鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果也表明 CB₂R在小膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)。這些結(jié)果證明，脊髓CB₂R主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，且Cnr2表達(dá)水平在慢性瘙癢小鼠中顯著升高。IF染色顯示DNFB模型小鼠中SDH內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯活化：數(shù)量增多、IBA1熒光強(qiáng)度增強(qiáng)、胞體增大、突起縮短且復(fù)雜度降低，EdU標(biāo)記顯示增殖型小膠質(zhì)細(xì)胞增加，這些結(jié)果表明脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活與慢性瘙癢之間存在密切關(guān)聯(lián)。

圖2.脊髓CB₂R主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞的激活而顯著增加

此后，作者進(jìn)一步驗(yàn)證了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在瘙癢中的功能性作用：小膠質(zhì)細(xì)胞消融（Tmem119; iDTR小鼠）或化學(xué)遺傳學(xué)抑制（Tmem119; hM4Di小鼠）顯著減輕瘙癢；而小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除Cnr2（Tmem119; Cnr2ᶠˡᵒˣ/ᶠˡᵒˣ）使瘙癢加劇且AM1241失效。此外，骨髓移植實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明中樞水平CB₂R對(duì)小鼠慢性瘙癢的重要調(diào)控作用，并且結(jié)合小膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除Cnr2的小鼠行為學(xué)證明脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞 CB₂R是AM1241起效的必要條件。

圖3.小膠質(zhì)細(xì)胞在慢性瘙癢和CB₂R介導(dǎo)的止癢作用中起重要作用

3. 小膠質(zhì)細(xì)胞 CB₂R 通過(guò)調(diào)控 p38/STAT1 通路與 SOCS3 表達(dá)重編程小膠質(zhì)細(xì)胞表型
為了詳細(xì)探究脊髓水平 CB₂R通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)瘙癢信號(hào)調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制，該論文進(jìn)行了小鼠脊髓單細(xì)胞RNA測(cè)序和通路分析。Naive小鼠組以靜息態(tài)Mg_Tmem119亞群為主，DNFB刺激后出現(xiàn)瘙癢特異性亞群Mg_Stat1和Mg_Stmn3，Mg_Stat1亞群則表現(xiàn)出獨(dú)特的分子特征，包括Stat1、Irf7、Bst2、Isg15等基因及趨化因子的顯著上調(diào)�；�因集富集分析顯示該亞群主要參與炎癥反應(yīng)通路，可能與慢性瘙癢密切相關(guān)。重復(fù)AM1241處理后，scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示脊髓中出現(xiàn)三個(gè)特征性小膠質(zhì)細(xì)胞亞群：Mg_Lpl、Mg_Mrc1和Mg_Socs3。其中，AM1241干預(yù)后脊髓SOCS3+小膠質(zhì)細(xì)胞的顯著富集是本研究的核心發(fā)現(xiàn)，表明小膠質(zhì)細(xì)胞 CB₂R激活可誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)上調(diào)并且抑制Mg_Stat1小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥相關(guān)基因的上調(diào)。

圖4.CB2R的激活誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化

接下來(lái)作者對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，首先IF結(jié)果表明小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)STAT1，且其磷酸化形式在DNFB刺激后明顯增多，AM1241治療后又被抑制。WB結(jié)果表明STAT1信號(hào)通路中介導(dǎo)STAT1的Y701磷酸化的pJAK1、p(S727)STAT1和p(Y701)STAT1在慢性瘙癢小鼠脊髓明顯增加，在A(yíng)M1241治療后又被顯著抑制。行為學(xué)結(jié)果表明鞘內(nèi)注射STAT1抑制劑Fludarabine也發(fā)揮明顯的止癢作用，進(jìn)一步證明了小膠質(zhì)細(xì)胞STAT1信號(hào)通路在慢性瘙癢中的重要功能。此外，作者對(duì)AM1241誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，IF結(jié)果表明在慢性瘙癢小鼠脊髓，AM1241誘導(dǎo)大量SOCS3+小膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)。CB₂R對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞STAT1及SOCS3信號(hào)的調(diào)控作用進(jìn)一步在IFNγ刺激的BV2細(xì)胞系中被證實(shí)。

圖5.CB₂R誘導(dǎo)激活SOCS3上調(diào)并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中與瘙癢相關(guān)的STAT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

先前研究報(bào)道Y701的磷酸化主要由pJAK1介導(dǎo)，但小膠質(zhì)細(xì)胞中p(S727) STAT1的磷酸化途徑尚未可知。p38作為小膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)的絲氨酸蘇氨酸激酶是否介導(dǎo)STAT1的S727磷酸化呢？首先作者發(fā)現(xiàn)DNFB模型中，脊髓背角p38的磷酸化形式p-p38+細(xì)胞的數(shù)目顯著增加，AM1241能夠顯著抑制這一變化。但AM1241對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖并無(wú)顯著抑制。WB結(jié)果顯示p-p38蛋白水平在DNFB模型小鼠中顯著上升，但在A(yíng)M1241重復(fù)處理后顯著抑制。此外，與野生型小鼠相比，脊髓背角單位面積的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及p-p38+細(xì)胞數(shù)量在 CB₂R-/-小鼠均明顯增多。熒光共標(biāo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清晰顯示p-p38特異性表達(dá)在tdTomato（Ai9）標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞中。重要的是，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，p38抑制劑SB203580能顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞STAT1的S727磷酸化，而對(duì)Y701無(wú)影響。行為學(xué)結(jié)果也再次證明了p38在小鼠慢性瘙癢中的重要作用。

圖6.p38激活小膠質(zhì)細(xì)胞（S727）STAT1磷酸化

4. 小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)神經(jīng) - 免疫交互作用增強(qiáng)脊髓瘙癢信號(hào)傳遞
為了進(jìn)一步探究小膠質(zhì)細(xì)胞下游慢性瘙癢相關(guān)信號(hào)通路以及小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的 CB₂R被激活后對(duì)下游瘙癢相關(guān)神經(jīng)元興奮性及興奮性突觸傳遞的影響，作者結(jié)合rAAV病毒逆標(biāo)示蹤、熒光蛋白標(biāo)記的GRPCre;Ai9和GRPRCreERT小鼠和電生理記錄。表明，在慢性瘙癢狀態(tài)下，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活，其激活的JAK1/p38-STAT1信號(hào)通路通過(guò)釋放細(xì)胞因子增強(qiáng)背角淺層GRP+/GRPR+神經(jīng)元及連接到臂旁核（PBN）的Vglut2+投射神經(jīng)元的興奮性和興奮性突觸傳遞，共同驅(qū)動(dòng)慢性瘙癢的病理進(jìn)程。而激活脊髓 CB₂R可誘導(dǎo)具有抗炎特性的SOCS3+小膠質(zhì)細(xì)胞亞群形成，通過(guò)抑制p38和STAT1的磷酸化，進(jìn)而降低GRP+/GRPR+中間神經(jīng)元及Vglut2+投射神經(jīng)元的活性與興奮性突觸傳遞，最終緩解慢性瘙癢。

圖7. CB₂R激動(dòng)劑治療抑制脊髓瘙癢相關(guān)神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞

03 機(jī)制創(chuàng)新性與生物學(xué)意義
該研究通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，首次明確脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞CB₂R是慢性瘙癢的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，其核心創(chuàng)新點(diǎn)在于：
1. 提出“小膠質(zhì)細(xì)胞- CB₂R-神經(jīng)免疫對(duì)話(huà)”新范式
本研究首次揭示：
a. 闡明了 “小膠質(zhì)細(xì)胞活化→p38/STAT1 通路激活→細(xì)胞因子釋放→脊髓神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)” 這一慢性瘙癢放大環(huán)路.
b. 抑制STAT1/p38通路，可減少瘙癢相關(guān)細(xì)胞因子釋放，最終降低瘙癢神經(jīng)元興奮性，為理解慢性瘙癢的中樞機(jī)制提供了全新視角。

2. 小膠質(zhì)細(xì)胞亞型的功能特異性
a. 慢性瘙癢中脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞從靜息態(tài)向促炎態(tài)（Mg_Stat1）轉(zhuǎn)化。
b. CB₂R激活通過(guò)誘導(dǎo)SOCS3表達(dá)，驅(qū)動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎態(tài)（Mg_Socs3）重編程。
c. 為靶向小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的治療策略提供了分子標(biāo)記。

3. 提供治療慢性瘙癢的有效藥物開(kāi)發(fā)新靶點(diǎn)
a. 系統(tǒng)性的研究數(shù)據(jù)證明靶向脊髓CB₂R對(duì)皮炎及銀屑病等小鼠模型慢性瘙癢具有明顯治療效果。
b. CB₂R可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞SOCS3的表達(dá)，進(jìn)而顯著抑制STAT1、p38及pJAK1激活并減少小膠質(zhì)細(xì)胞源性的細(xì)胞因子釋放，抑制慢性瘙癢信號(hào)。
c. CB₂R可通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞及其下細(xì)胞因子，抑制脊髓瘙癢相關(guān)神經(jīng)元興奮性及興奮性突觸，抑制慢性瘙癢信號(hào)。