多組學(xué)構(gòu)建癌癥m6A甲基化圖譜并揭示腫瘤惡化關(guān)鍵機(jī)制的研究
2025年3月24日，加拿大瑪格麗特公主癌癥中心/多倫多大學(xué)何厚勝（Housheng Hansen He）團(tuán)隊(duì)在《Nature Genetics》（IF29/Q1）上發(fā)表了題為“The landscape of N6-methyladenosine in localized primary prostate cancer”的科研成果。研究對(duì)162例局限性原發(fā)前列腺癌樣本的m6A甲基化修飾圖譜進(jìn)行系統(tǒng)性探索，并結(jié)合m6A表觀轉(zhuǎn)錄組（meRIP-seq）、基因組（WGS）、轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）和蛋白組等多組學(xué)數(shù)據(jù)，揭示了m6A修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的多層級(jí)調(diào)控機(jī)制（包括種系遺傳風(fēng)險(xiǎn)、微環(huán)境失調(diào)、體細(xì)胞突變和轉(zhuǎn)移等），確立了整體和位點(diǎn)特異性m6A模式均具有潛在的生物標(biāo)志物價(jià)值。
本研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在不同患者中具有顯著性差異，其整體模式受種系遺傳和體細(xì)胞協(xié)同調(diào)控，鑒定出的5種m6A患者亞型（P1-P5）和5種m6A修飾亞型（M1-M5），與腫瘤分級(jí)、腫瘤大小、侵襲性導(dǎo)管內(nèi)癌和篩狀結(jié)構(gòu)（IDC/CA）分型、基因組不穩(wěn)定性及術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。研究進(jìn)一步鑒定出1,350個(gè)m6A數(shù)量性狀位點(diǎn)（m6A-QTLs），揭示種系遺傳變異對(duì)m6A水平的調(diào)控，并證實(shí)缺氧微環(huán)境可介導(dǎo)m6A譜系改變。此外，功能驗(yàn)證表明，VCAN等基因上的m6A位點(diǎn)通過IGF2BP蛋白家族調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率，直接促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，且與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)�？傮w而言，本研究揭示了m6A修飾與遺傳背景、微環(huán)境及腫瘤表型之間的復(fù)雜互作，為開發(fā)新型預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供了重要理論依據(jù)。
英文標(biāo)題：The landscape of N6-methyladenosine in localized primary prostate cancer
中文標(biāo)題：局限性原發(fā)前列腺癌中的m6A甲基化圖譜
發(fā)表時(shí)間：2025-3-24
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：IF29/Q1
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、H3K27ac ChIP、WGS、蛋白組等
作者單位：加拿大多倫多大學(xué)、美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校等
DOI：10.1038/S41588-025-02128-y
圖形摘要：m6A修飾通過IGF2BP蛋白穩(wěn)定VCAN mRNA并促進(jìn)其翻譯，從而增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞侵襲
研究方法
隊(duì)列與樣本：
研究納入了162例經(jīng)根治性前列腺切除術(shù)治療的、國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）中危局限性前列腺癌患者的治療前腫瘤樣本，并進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)控，最終148例樣本進(jìn)入最終分析隊(duì)列。
多組學(xué)策略：
- m6A MeRIP-seq：繪制前列腺癌全轉(zhuǎn)錄組m6A修飾圖譜，并基于peak水平的m6A豐度進(jìn)行共識(shí)聚類分析，鑒定出5種m6A患者亞型（P1-P5）和5種m6A修飾亞型（M1-M5）。
- 多組學(xué)整合：每例樣本均匹配全基因組測(cè)序（148例）、DNA甲基化（146例）、H3K27ac ChIP-seq（29例）、超深度RNA-seq（92例）和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)（54例），評(píng)估m(xù)6A與其他分子特征（如RNA豐度、拷貝數(shù)變異、DNA甲基化）之間的復(fù)雜關(guān)聯(lián)，并在全基因組范圍內(nèi)鑒定出m6A數(shù)量性狀位點(diǎn)（m6A-QTLs），形成完整的中心法則調(diào)控鏈數(shù)據(jù)集。
臨床相關(guān)性分析：
- 生存分析：Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估m(xù)6A特征與患者復(fù)發(fā)（BCR）風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)。隨機(jī)效應(yīng)Meta分析整合6個(gè)獨(dú)立隊(duì)列（1,239例）驗(yàn)證m6A調(diào)控基因的預(yù)后價(jià)值。
- 功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：在PC-3等前列腺癌細(xì)胞系中，通過shRNA/siRNA敲低、dCasRx-METTL3系統(tǒng)進(jìn)行位點(diǎn)特異性m6A writer、RIP-qPCR驗(yàn)證IGF2BP蛋白結(jié)合、核糖體圖譜分析翻譯效率、雞胚模型檢測(cè)細(xì)胞外滲能力，驗(yàn)證了VCAN等關(guān)鍵基因的m6A修飾功能。
（1）局限性前列腺癌的m6A修飾圖譜
研究首先通過MeRIP-seq技術(shù)對(duì)148例質(zhì)量合格的前列腺癌樣本進(jìn)行深度測(cè)序，系統(tǒng)描繪了局限性前列腺癌的全轉(zhuǎn)錄組m6A修飾圖譜。分析顯示，前列腺癌中m6A Peak數(shù)量呈高度異質(zhì)性，中位值為7,611±2,922個(gè)，部分腫瘤可檢測(cè)超過12,000個(gè)Peaks（圖1a）。同時(shí)，m6A分布具有異質(zhì)性，約16%的Peaks（5,146個(gè)）僅在單個(gè)樣本中被鑒定，約20%（6,467個(gè)）在至少一半樣本中出現(xiàn)，僅0.5%（167個(gè)）在所有樣本中均被檢測(cè)到（圖1f）。值得注意的是，關(guān)鍵前列腺促癌基因如AR、MYC、MALAT1和FOXA1頻繁發(fā)生m6A甲基化，而抑癌基因TP53、PTEN和RB1則極少被修飾，這種"促癌基因偏好性"提示m6A可能參與轉(zhuǎn)錄后致癌程序。
此外，研究鑒定出32,051個(gè)高置信度聯(lián)合Peak，這些Peak顯著富集于終止密碼子附近和3' UTR區(qū)，符合m6A調(diào)控mRNA穩(wěn)定性的經(jīng)典模式�；バ畔⒎治鼋沂緈6A與RNA豐度在約20%基因（839個(gè)）中存在顯著關(guān)聯(lián)，且整體呈負(fù)相關(guān)，支持m6A介導(dǎo)mRNA降解的功能，但與蛋白質(zhì)豐度、拷貝數(shù)變異、DNA甲基化等其他分子特征關(guān)聯(lián)較少（圖1g）。
圖1：前列腺癌m6A修飾圖譜
（2）前列腺癌的m6A亞型和臨床相關(guān)性
通過對(duì)5,203個(gè)m6A Peak進(jìn)行共識(shí)聚類，研究鑒定出具有不同m6A模式的5種患者亞型（P1-P5）和5種m6A亞型（M1-M5）（圖2a）。這些m6A亞型與多個(gè)臨床病理特征相關(guān)（圖2b），包括腫瘤大小和范圍（病理T分期，pT）（圖2c）、侵襲性導(dǎo)管內(nèi)癌和篩狀結(jié)構(gòu)（IDC/CA）陽(yáng)性率（圖2d）、基因組不穩(wěn)定性以及術(shù)后復(fù)發(fā)率（圖2e）。從分子機(jī)制角度來說，不同亞型攜帶特征性的m6A調(diào)控因子變異，P4亞型富集YTHDF1基因擴(kuò)增（圖2g），而P2亞型常見FANCA基因缺失（圖2h），這些變異表現(xiàn)出m6A writer、eraser、reader基因的體細(xì)胞拷貝數(shù)變異特征模式。
此外，研究鑒定出與關(guān)鍵臨床指標(biāo)（年齡、病理分級(jí)、IDC/CA狀態(tài)等）相關(guān)的m6A位點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)了8個(gè)m6A Peaks與病理ISUP分級(jí)相關(guān)（圖2i），13個(gè)Peaks與IDC/CA狀態(tài)相關(guān)。其中，NSD1基因上的m6A Peak豐度在IDC/CA陽(yáng)性腫瘤中顯著升高（圖2j），而NSD1已知可增強(qiáng)雄激素受體（AR）轉(zhuǎn)錄激活，提示m6A可能通過調(diào)控AR信號(hào)軸促進(jìn)結(jié)構(gòu)侵襲。
圖2：m6A的分子分型與臨床相關(guān)性
鑒于前列腺癌是最具遺傳性的實(shí)體瘤之一，研究深入探討了種系遺傳對(duì)m6A甲基化的調(diào)控作用。在約600M的種系多態(tài)性（SNP）中，篩選出4,755個(gè)位于已注釋m6A位點(diǎn)的SNP，其中35個(gè)與MeRIP-seq鑒定的Peak重疊且等位基因含有A堿基。等位基因頻率分析顯示，活性m6A位點(diǎn)中A等位基因頻率顯著高于非活性位點(diǎn)（中位值0.83 vs 0.45），提示非A等位基因與m6A豐度降低相關(guān)（圖3a-f）。
通過m6A-QTL分析，在全基因組范圍內(nèi)鑒定出14,775個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的m6A-QTL，涵蓋1,350個(gè)特異性Peak（圖3g）。其中11%的SNP直接位于Peak內(nèi)，4%與Peak存在HiChIP驗(yàn)證的染色質(zhì)環(huán)互作，揭示遠(yuǎn)端調(diào)控的可能。代表性案例是rs4951018與SLC45A3基因m6A、RNA和蛋白豐度的三重關(guān)聯(lián)（圖3h），該基因是前列腺癌常見融合基因SLC45A3-ELK4的組分。上述研究首次建立前列腺癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)與表觀轉(zhuǎn)錄組的直接聯(lián)系，提示m6A-QTL可作為中介機(jī)制解釋GWAS信號(hào)的生物學(xué)功能。
圖3：m6A在原發(fā)性前列腺癌中的種系相關(guān)性
缺氧是前列腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，研究探究了其對(duì)m6A圖譜的系統(tǒng)性影響。通過將m6A Peak豐度與先前計(jì)算的缺氧評(píng)分進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，鑒定出2,280個(gè)缺氧相關(guān)Peak。這些Peak在缺氧腫瘤中豐度普遍降低，且顯著富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)組織相關(guān)基因（圖4a），提示缺氧可能通過m6A介導(dǎo)基因表達(dá)變化。m6A患者亞型也與缺氧相關(guān)，其中突變較少的P5簇最常氧（圖4b）。
進(jìn)一步驗(yàn)證中，將前列腺癌細(xì)胞系V16A和PC-3暴露于缺氧環(huán)境中24小時(shí)后行MeRIP-seq，發(fā)現(xiàn)缺氧特異性Peak與患者樣本中的缺氧響應(yīng)Peak顯著重疊（圖4f-g）。HNRNPLL基因的Peak在三組數(shù)據(jù)中均顯示一致的缺氧負(fù)相關(guān)（圖4h），證實(shí)其作為缺氧響應(yīng)表觀轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的準(zhǔn)確性。
圖4：腫瘤缺氧與廣泛的m6A調(diào)控相關(guān)
研究系統(tǒng)評(píng)估了m6A在預(yù)后預(yù)測(cè)中作為生物標(biāo)志物的潛力。
首先，m6A調(diào)控基因本身頻繁發(fā)生體細(xì)胞變異，大多數(shù)腫瘤都存在影響m6A酶編碼基因突變（圖5a），在包含1,239名患者的六個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的薈萃分析中，m6A調(diào)控基因的拷貝數(shù)變異能顯著預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)（圖5b）。其中VIRMA（Writer）和YTHDF3（Reader）擴(kuò)增顯著預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低（圖5b-d）。這種關(guān)聯(lián)可能反映這些基因在特定背景下的抑癌功能。
其次，TP53和NKX3-1等抑癌基因的生存分析顯示，m6A豐度提供了顯著的預(yù)后信息（圖5e）。TP53缺失背景下，更高的m6A修飾水平與與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)（HR: 3.35）（圖5f-i）；NKX3-1缺失時(shí)也觀察到類似趨勢(shì)（HR=3.60）。這表明m6A可放大抑癌基因失活的后果。更直接的證據(jù)來自Peak水平分析：在20,334個(gè)常見Peak中，INHBA（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族）、VCAN（細(xì)胞外基質(zhì)）和ZFHX4（轉(zhuǎn)錄因子）上的Peak存在顯著預(yù)測(cè)價(jià)值，INHBA、VCAN和ZFHX4轉(zhuǎn)錄本上的特定m6A Peaks與腫瘤復(fù)發(fā)強(qiáng)烈相關(guān)（圖5j），其中VCAN Peak存在與與更差的患者結(jié)局相關(guān)（圖5k）。
圖5：m6A位點(diǎn)的生物標(biāo)志物潛力分析
在功能驗(yàn)證環(huán)節(jié)，研究聚焦于VCAN這一預(yù)后最顯著的m6A靶點(diǎn)。VCAN編碼蛋白聚糖versican，是腫瘤基質(zhì)的關(guān)鍵成分。研究發(fā)現(xiàn)，VCAN m6A Peak陽(yáng)性腫瘤（~15%）的VCAN mRNA和蛋白豐度均顯著高于陰性腫瘤，且該關(guān)聯(lián)在5個(gè)獨(dú)立患者隊(duì)列（981例）中一致。高VCAN mRNA表達(dá)與更差的生存結(jié)局顯著相關(guān)（圖6a-b）。為證實(shí)VCAN的功能作用，研究在PC-3細(xì)胞系（高內(nèi)源性VCAN m6A）中敲低VCAN，結(jié)果顯示可以顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力（圖6c）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，VCAN敲低可以顯著降低異種移植瘤的生長(zhǎng)（圖6d）和轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞外滲。
在分子機(jī)制的探索上，研究人員揭示了m6A如何通過reader蛋白調(diào)控VCAN。使用dCasRx/METTL3系統(tǒng)對(duì)VCAN轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行位點(diǎn)特異性m6A添加后，VCAN的m6A修飾水平、mRNA和蛋白質(zhì)豐度均顯著增加（圖6e-f），并增強(qiáng)了PC-3細(xì)胞的增殖和遷移（圖6g-h）。RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)VCAN mRNA是m6A reader蛋白IGF2BP1/2/3的共同靶標(biāo)（圖6i）。敲低這三個(gè)reader蛋白會(huì)降低VCAN mRNA和蛋白豐度（圖6j），并抑制細(xì)胞增殖和侵襲。
圖6：VCAN在體外和體內(nèi)促進(jìn)腫瘤增殖和進(jìn)展
本研究系統(tǒng)繪制了局限性前列腺癌的m6A圖譜，揭示了其與種系遺傳、體細(xì)胞突變、腫瘤微環(huán)境（如缺氧）和臨床結(jié)局的復(fù)雜關(guān)聯(lián)。研究不僅將m6A確立為一種有前景的生物標(biāo)志物，更重要的是通過VCAN等案例闡明了m6A通過穩(wěn)定關(guān)鍵癌基因mRNA來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的具體分子機(jī)制。這為開發(fā)靶向m6A調(diào)控通路或其下游靶點(diǎn)的新型治療策略（如靶向IGF2BPs）提供了理論依據(jù)。
MeRIP-seq技術(shù)是繪制全轉(zhuǎn)錄組m6A修飾圖譜的經(jīng)典方法。在本研究中，它不僅是發(fā)現(xiàn)工具（鑒定出32,051個(gè)高置信度m6A peaks），更通過將MeRIP-seq數(shù)據(jù)與基因組（SNP、CNA）、轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）、蛋白質(zhì)組、臨床病理數(shù)據(jù)整合，研究得以從關(guān)聯(lián)走向機(jī)制，回答了“m6A在哪里”、“誰(shuí)調(diào)控它”、“它影響什么”以及“它如何影響疾病”等一系列核心問題，為解析復(fù)雜疾病機(jī)制提供了方法學(xué)思路參考。
參考文獻(xiàn)：
Xu X, …, He HH，et al. The landscape of N6-methyladenosine in localized primary prostate cancer. Nat Genet. 2025 Mar 24.. doi: 10.1038/s41588-025-02128-y.
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