分子互作研究常用技術(shù)及應(yīng)用案例分享

ChIP技術(shù)
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。利用已知蛋白的特異性抗體，將與蛋白相互作用的DNA從復(fù)合物中分離出來，常見用于確定特定轉(zhuǎn)錄因子或其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，以及這些蛋白如何調(diào)控基因表達(dá)。

案例分享：
Interleukin-34-orchestrated tumor-associated macrophage reprogramming is required for tumor immune escape driven by p53 inactivation

Immunity. 2024 Oct 8;57(10):2344-2361.e7. doi: 10.1016/j.immuni.2024.08.015. Epub 2024 Sep 24. PMID: 39321806 IF=25.5

為了確定p53是否結(jié)合IL-34的調(diào)控區(qū)域，使用p53抗體進(jìn)行了染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)，隨后進(jìn)行了高通量測序。在IL34和CDKN1A(p21)位點(diǎn)觀察到p53的結(jié)合（圖K）。ChIP-PCR和也揭示了p53與IL34啟動(dòng)子的結(jié)合（圖L）。

DNA pull down
DNA pull-down是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于研究蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用。該技術(shù)針對(duì)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性DNA探針并經(jīng)過脫硫生物素標(biāo)記，標(biāo)記后探針可以和偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素親和結(jié)合，再與總蛋白提取物進(jìn)行孵育，有互作的蛋白質(zhì)可以和DNA探針特異性結(jié)合，形成磁珠-DNA探針-蛋白復(fù)合物，洗滌去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，再經(jīng)過洗脫得到目的DNA探針－蛋白質(zhì)復(fù)合物，最后通過Western Blot或質(zhì)譜(MS)鑒定蛋白質(zhì)類型，這種方法常用于識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子、DNA修復(fù)蛋白或其他與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。

案例分享

DNA pulldown后WB顯示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間有差異條帶

RIP技術(shù)
RIP技術(shù)（RNA Binding Protein lmmunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過程的有力工具。該技術(shù)主要是運(yùn)用目標(biāo)蛋白的特異性抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或高通量測序分析。

案例分享

RIP后WB,結(jié)果顯示absin與進(jìn)口產(chǎn)品效果相當(dāng)，與IgG組存在差異條帶

RNA pull down
RNA pull-down是研究RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。先將RNA進(jìn)行標(biāo)記（如生物素標(biāo)記），再與細(xì)胞裂解液共同孵育，從而形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，進(jìn)而檢測與之結(jié)合的蛋白質(zhì)。復(fù)合物洗脫后，通過Western blot(pull down-WB)實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜(pull down­-MS)技術(shù)檢測目標(biāo)RNA是否與某些蛋白相互作用。

案例分享

pulldown后銀染及富集效果檢測qPCR

CoIP
免疫(共)沉淀(IP/CoIP)是基于抗體和蛋白的特異性親和作用，通過捕獲與蛋白或抗原特異性結(jié)合的抗體，進(jìn)而從復(fù)雜的樣品中捕獲及富集目標(biāo)蛋白，同時(shí)可以測定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子。

案例分享
Targeted knockdown of PGAM5 in synovial macrophages efficiently alleviates osteoarthritis

Bone Res. 2024 Mar 4;12(1):15. doi: 10.1038/s41413-024-00318-8.PMID: 38433252 IF=12.7

DVL2和PGAM5在M1和M2巨噬細(xì)胞中的免疫共沉淀(abs955)

GST Pull Down
GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)基于GST(glutathione-S-transferase)，即⾕胱⽢肽-S-轉(zhuǎn)移酶蛋⽩，可以與⾕胱⽢肽(Glutathione，GSH)結(jié)合，將GSH固定于磁珠上，形成GSH-磁珠，將已知蛋⽩X與GST融合表達(dá)，獲得的GST-X蛋⽩可與GSH-磁珠結(jié)合，若體系中存在與X蛋⽩互做的蛋⽩Y，則會(huì)形成“磁珠-GSH-GST-X-Y”復(fù)合物，與X蛋⽩互做的蛋⽩即可被分離并檢測。