肉類(lèi)顏色測(cè)量指南之肉色研究方法G-J
G.分離肌紅蛋白用于體外研究
原則：
純化肌紅蛋白有時(shí)是必要的，例如用于比較 不同物種 肌紅蛋白（Mb）的自氧化速率。 肌紅蛋白（分子量 約 16,949）可以從骨骼肌或心肌中輕松純化 。其紅色便于在層析過(guò)程中直觀觀察。該方法使用相對(duì)廉價(jià)的設(shè)備即可獲得較高產(chǎn)率的肌紅蛋白（Faustman和Phillips，2001；改編自Wittenberg和Wittenberg，1981年以及Trout和Gutzke，1996年的早期方法）。
樣品、試劑和溶液
1. 去脂去筋的牛肉塊
2. 均質(zhì)化緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
3. 氫氧化鈉
4. 硫酸銨
5. 透析緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
6. 色譜洗脫緩沖液（5 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.5）在4 °C
記下
為了將亞鐵肌紅蛋白的形成降至最低，均質(zhì)化和所有后續(xù)步驟應(yīng)在0至5 ° C和高pH（8.0至8.5）下進(jìn)行。
設(shè)備
攪拌器、紗布、 4℃ 下 20,000×g 轉(zhuǎn)速離心機(jī)、透析管（分子量截留值12 ，000至14 ，000）、 Sephracryl S - 200HR色譜柱（30× 2.5至cm）、蠕動(dòng)泵。需要額外試劑和設(shè)備來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，或 基于其消光系數(shù)計(jì)算肌紅蛋白濃度 。
制備勻漿
1. 將150克切碎的肌肉與450毫升勻漿緩沖液放入攪拌機(jī)中進(jìn)行勻漿處理高速運(yùn)轉(zhuǎn)1至2分鐘。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中， 在4℃ 下以3000× g 離心10分鐘。
3. 棄去池上清液， 用氫氧化鈉 調(diào)節(jié)所得上清液的pH至8.0。
4. 用兩層紗布過(guò)濾上清液，以去除脂質(zhì)和結(jié)締組織顆粒。
沉淀肌紅蛋白
1. 將濾液飽和至70%硫酸銨濃度（472克硫酸銨/升濾液），用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，
攪拌1小時(shí)。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中，4℃條件下以18,000× g 離心20分鐘，去除沉淀蛋白。
3. 合并上清液，棄去沉淀。
4. 將上清液從70%濃度調(diào)整至100%硫酸銨飽和度（通過(guò)添加（上清液中額外添加228克硫酸銨/L），用 氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH至8.0， 并攪拌1小時(shí) 。
5. 將勻漿液均分至各試管中，隨后以1000×g離心1小時(shí)。20,000 × g ，4 ° C。棄去上清液，加入1或2 mL冰冷卻緩沖液以幫助沉淀物的回收。
透析和純化肌紅蛋白
1. 將沉淀的肌紅蛋白轉(zhuǎn)移至透析管中，并在4 ° C下使用透析緩沖液（1體積蛋白質(zhì)，10體積緩沖液）透析24小時(shí)，每8小時(shí)更換緩沖液。
2. 使用蠕動(dòng)泵 ，用色譜洗脫 緩沖液（3個(gè)色譜柱體積）平衡Sephacryl S-200 HR色譜柱。
3. 將透析液加入色譜柱，以60mL/小時(shí)的流速用色譜洗脫緩沖液洗脫肌紅蛋白提取物。該步驟將血紅蛋白與肌紅蛋白分離。血紅蛋白將首先洗脫為淡紅色/棕色條帶。肌紅蛋白隨后作為 明顯可見(jiàn)的深紅色條帶洗脫。
4. 使用分餾收集器收集含肌紅蛋白的餾分。
肌紅蛋白濃縮物
1. 將所有含肌紅蛋白的組分進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用天然聚丙烯酰胺凝膠電泳法可評(píng)估肌紅蛋白提取物的純度， 該提取物應(yīng)產(chǎn)生一條分子量為17kDa的單一蛋白條帶 。
2. 使用離心濃縮器濃縮肌紅蛋白溶液。
3. 或者（步驟2的替代方案），將肌紅蛋白溶液飽和至100%硫酸銨濃度（761克硫酸銨/升溶液），將pH調(diào)節(jié)至8.0，攪拌溶液1 小時(shí) 。 將溶液均分至各試管中，并在4°C下以20,000×g離心1小時(shí) ， 000×g g 。 排棄上清液，并按前述方法透析肌紅蛋白 。
4. 或者（步驟2和3），肌紅蛋白可通過(guò) Trout和Gutzke（1996）所述 的超濾法濃縮。
5. 測(cè)定肌紅蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度，并分裝至 -80℃ 冷凍保存。
記下
這種肌紅蛋白分離程序的產(chǎn)量相對(duì)較低，需要2到3個(gè)月的 收集才能得到大量的 肌紅蛋白。
參考文獻(xiàn)
Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鮮肉變色的測(cè)量. 《食品分析化學(xué)最新協(xié)議》 第F3.3單元，S.J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.，紐約。
特勞特，G.R.和D.A.古茲克。1996年。一種簡(jiǎn)單、快速的制備方法，用于分離和純化氧肌紅蛋白。肉類(lèi)科學(xué)43 ：1- 13 。
Wittenberg，J. B.和B. A. Wittenberg. 1981.肌紅蛋白的制備. Methods Enzymol. 76 ：29–42.
H.從牛骨骼肌中分離線粒體
原則
線粒體分離包含三個(gè)步驟：細(xì)胞裂解、勻漿和離心。使用蛋白酶處理骨骼肌可顯著促進(jìn)線粒體釋放，同時(shí)提高產(chǎn)量。
試劑
1. 1 M蔗糖：將342.3 g蔗糖溶于1 L蒸餾水中，混勻，分裝成20 mL等分試樣， 于-20℃ 保存。
2. 0.1 M Tris/MOPS：將12.1克Tris[三（羥甲基）氨基甲烷]溶解于500 mL 蒸餾水中 ， 調(diào)節(jié)pH 至7 。 使用MOPS [ 3 -（N -嗎啉代）丙磺酸]粉末，將溶液定容至1 L，并于4 ° C保存。
3. 1 M Tris/鹽酸：將121.14 g Tris溶于500 mL蒸餾水中， 用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4 ， 將溶液稀釋至1 L并室溫保存 。
4. 1 M EDTA：將372.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）溶于500 mL 蒸餾水中，并于4℃保存 。
5. 10% BSA：將10 g BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL蒸餾水中， 存放于-20℃ 。
7. 10mMEDTA：將2.92gEDTA溶于1L蒸餾水中，并于4℃ 保存 。
8. 0.5%BSA：將5 g BSA溶于1 L蒸餾水中，并于-20 °C 下保存。
9. 納加酶：配制20毫克/100毫升分離液濃度的納加酶溶液（即20毫克/100毫升）。
重要提示： 其他蛋白酶（胰蛋白酶）的選擇取決于研究者偏好和方案，以及用于分離線粒體
的肌肉類(lèi)型。
關(guān)鍵步驟3： 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天制備所有緩沖液，以避免儲(chǔ)存的緩沖液中細(xì)菌/酵母生長(zhǎng)。
關(guān)鍵步驟4： 由于pH值取決于溫度，所有溶液的pH值都應(yīng)在25°C時(shí)測(cè)量。
操作步驟
1. 取5克（精確至0.1克）目標(biāo)肌肉組織樣本，確保不含可見(jiàn)脂肪或結(jié)締組織，隨后切成小塊。
2. 取小燒杯，將肌肉組織浸入20毫升冰浴PBS（磷酸鹽緩沖液）中，其中添加了10 mM EDTA。
3. 用剪刀把肌肉切成小塊。
4. 用含10 mM EDTA的冰凍PBS緩沖液對(duì)碎肌肉進(jìn)行2-3次清洗。
5. 將切碎的肌肉重新懸浮于5毫升冰凍的含10 mM EDTA的PBS溶液中。
6. 以200 × g 離心5分鐘，棄去上清液。
重要提示： 組織與分離緩沖液的最佳比例范圍為1：5 至1：10（w/v）。
8. 使用 以1 600 rpm 轉(zhuǎn)速運(yùn)行的Teflon杵的Potter-Elvehjem研磨器均質(zhì)化肌肉組織； 將均質(zhì)化的肌肉搗碎10至20次 。
重要提示： 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前5分鐘將玻璃器皿置于冰浴中預(yù)冷。勻漿及后續(xù)步驟必須在4 ℃下進(jìn)行,以盡量減少磷脂酶和蛋白酶的激活，從而避免對(duì)肌肉造成損傷。
9. 將勻漿液轉(zhuǎn)移至50 mL聚丙烯Falcon管中， 在4℃下以700× g 離心 10分鐘 。
10. 將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中， 4℃ 以8000× g 離心10分鐘。
14. 使用Biuret/Bradford法中的一種方法測(cè)定線粒體濃度Bicinchoninic Acid assay（BCA）法。
參考文獻(xiàn)
Bhattacharya，S. K.，J. H. Thakar，P. L. Johnson和D. R. Shanklin. 1991.使用含有EDTA和Nagarse的離子介質(zhì)從
倉(cāng)鼠中分離骨骼肌線粒體。分析生物化學(xué)192： 344 — 349 。
Frezza，C.，S. Cipolat，and L. Scorrano. 2007 .小鼠肝臟、肌肉 和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中線粒體的分離與功能。
Nat. Protoc. 2： 287 —295。
Mohan，A.，M. C. Hunt，S. Muthukrishnan，T. A. Houser和T. E. Barstow. 2010c. 分區(qū)乳酸和蘋(píng)果酸脫氫酶對(duì)
肌紅蛋白氧化還原形式穩(wěn)定性的研究。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志58： 7021 — 7029 。
i. 完整肌肉或絞肉的耗氧量
原則
新鮮切割的肉片需經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的氧氣處理（即讓其充分氧化），隨后進(jìn)行真空包裝。通過(guò)酶呼吸作用導(dǎo)致的氧化肌肉組織（OMb）減少量，可作為 衡量組織 氧氣消耗能力 的 指標(biāo) 。 在25℃水浴或培養(yǎng)箱中 ， 立即記錄400-700納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的反射光譜 ，并在20分鐘后再次測(cè)量。 氧化肌紅蛋白水平通過(guò) K / S 轉(zhuǎn)換公式計(jì)算得出，具體方法詳見(jiàn)第九節(jié)。 K / S 610/ K / S 525比值越高，表明OMb含量越高。氧氣消耗量（OC）以 首次與末次測(cè)量的百分比差異 形式呈現(xiàn)。
設(shè)備和用品
1. 真空包裝機(jī)
2. 聚氯乙烯薄膜
4. 能掃描并記錄400至700 nm表面反射率的分光光度計(jì)（見(jiàn) 第IX節(jié)）
操作步驟
1. 例如，所有待測(cè)樣品必須處于相同溫度（4 ° C）下，否則溫度越高，樣本的耗氧量越快，而藻華發(fā)育（即富氧）則越慢；溫度越低，耗氧量越慢，藻華發(fā)育則越快。
2. 為確保氧氣供應(yīng)均勻，所有樣本需保存在 2-4℃ 的環(huán)境中。對(duì)于完整 肌肉樣本 ，應(yīng)用鋒利刀具切取3厘米×3厘米×2厘米的樣本塊 ，盡量去除可見(jiàn)脂肪和結(jié)締組織。研磨樣本則需準(zhǔn)備體積相當(dāng)?shù)木鶆驂簩?shí)立方體，其可見(jiàn)脂肪含量應(yīng)與樣本瘦肉部分的典型水平相當(dāng)。切記使用鈍刀具，以免破壞表面結(jié)構(gòu)。同時(shí)避免對(duì)研磨樣本的表面進(jìn)行過(guò)度操作或擠壓（參見(jiàn)Madhavi和 Carpenter ， 1993 年研究）。
3. 如果表面不是新鮮的切割面，那么在開(kāi)始開(kāi)花步驟之前， 只需去除一層薄薄的表面層，以暴露新鮮的組織 。
4. 用一小塊透氣膜覆蓋新切面，防止干燥。將聚氯乙烯膜（常用）平鋪一層，確保表面均勻接觸空氣。記錄膜的透氣性。
5. 在2至4 °C（或其他標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間）下進(jìn)行2小時(shí)的顯色。注意使所有樣品在該步驟中保持相同的溫度，因?yàn)轱@色非常依賴(lài)于溫度。
6. 花開(kāi)后 ， 去除聚氯乙烯薄膜并將樣品放入氧氣滲透性極低的袋中 。用高真空快速真空包裝；保持樣品間的真空均勻。
7. 立即掃描樣品表面，以 測(cè)定400至700nm范圍內(nèi)的反射率 ，從而 確定初始OMb 。 光譜儀必須通過(guò) 真空袋薄膜進(jìn)行校準(zhǔn)。
8. 為加快氧氣消耗，使用25 ° C的培養(yǎng)箱或水浴。20分鐘后（或根據(jù)所用肉類(lèi)的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間）重新掃描同一表面。
計(jì)算
%OMb =[ K/S 610÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 610÷ K/S 525（100%
DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（100% OMb）][ ×100 ]。
氧消耗量 = [（初始OMb%−最終OMb%）÷初始OMb%]×100。
記下
馬達(dá)維和卡彭特（1993年）提出了一種利用反射光譜儀測(cè)量氧氣消耗量（OC）的檢測(cè)方法。該方法通過(guò)配備反射光譜附件的分光光度計(jì)， 首先對(duì)真空包裝樣品的表面有機(jī)物（OMb）含量 進(jìn)行測(cè)定， 并以5分鐘 為間隔（總計(jì)20分鐘）在4℃ 條件下重復(fù)測(cè)量。 樣品尺寸經(jīng)過(guò)調(diào)整（2.5×2.5×0.5厘米）以適應(yīng)反射光譜儀的樣品接口。有機(jī)物的相對(duì)濃度采用克日維茨基（1979年）的方法計(jì)算，但唐等人（2004年）對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，并推薦了 修訂后的波長(zhǎng)參數(shù)（詳見(jiàn)第九節(jié)）。 氧氣消耗量以百分比形式表示 ，即 真空包裝樣品在10分鐘內(nèi)消耗的初始表面有機(jī)物量 。
Mancini、Hunt和Kropf（2003）報(bào)告了一種使用610nm反射率直接測(cè)定OMb 的方法。這是可能的，因?yàn)镺Mb在610nm處具有其獨(dú)特的反射率，而610nm 對(duì)DMb和MMb都是等滲的（關(guān)于肉表面反射率測(cè)量和 K/S 比率 的進(jìn)一步討論，參見(jiàn)第IX節(jié)）。 該方法已成功使用（參見(jiàn)King等人 ， 2011）。
部分研究采用單位時(shí)間內(nèi)有機(jī)物（OMb）百分比變化值來(lái)報(bào)告實(shí)際“耗氧量”，但這種方法操作繁瑣且耗時(shí)。對(duì)于大量樣本，通常將“耗氧量”計(jì)算為樣本初始有機(jī)物含量的“平均百分比降幅”。 樣本脫氧時(shí)間需標(biāo)準(zhǔn)化 ， 通常 20分鐘即可檢測(cè)出樣本差異 。
參考文獻(xiàn)
King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測(cè)量時(shí)間對(duì)肌紅蛋白還原活性和耗氧量
與長(zhǎng)肌肉色穩(wěn)定性儀器測(cè)量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 —942。
曼奇尼 ，R . A .，M . C . 亨特 ，和D . H . 克羅普 .2003. 610納米反射率估計(jì)牛肉表面的氧合血紅蛋白含量 . Meat Sci . 64 ：157— 162 .
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過(guò)近紅外血氧測(cè)定法檢測(cè)三種后強(qiáng)直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。
唐，J.，C.福斯特曼，和T. A.霍格蘭。2004年。重新審視克日維茨基，水性肉類(lèi)提取物中肌紅蛋白氧化還原形式分光光度測(cè)定的方程式。食品科學(xué)雜志69： C717 — C720 。
J.完整肉或碎肉的肌紅蛋白還原能力
原則
首先將樣本切片浸入稀硝酸鈉溶液中浸泡20分鐘，使表面色素氧化生成甲基甲基藍(lán)（MMb） 。隨后將切片（厚度1.27厘米）真空包裝，在30℃環(huán)境下通過(guò)測(cè)量 K/S 比值 （572/525納米波長(zhǎng)）持續(xù)監(jiān)測(cè)表面MMb含量2小時(shí)。樣品的還原能力定義為培養(yǎng)期間 表面MMb濃度的百分比降幅。MMb濃度的下降程度可視為組織還原鐵血紅素鐵 能力的反映。
試劑
1. 0.3%（w/w）亞硝酸鈉溶液：稱(chēng)取大燒杯，稱(chēng)取 3.0 g NaNO 2 加入燒杯中，加蒸餾水至1000克，每日新鮮配制，室溫孵育。
操作步驟
1. 取一塊3cm×3cm×2cm的肌肉組織樣本（無(wú)可見(jiàn)脂肪或結(jié)締組織），若使用絞肉則取一塊大小相近且緊密壓實(shí)的樣本，以防止樣本浸入時(shí)碎裂。
2. 務(wù)必先對(duì)樣本進(jìn)行定位，以便確定后續(xù)要評(píng)估的表面。該表面可能是新切面，也可能是展示過(guò)的表面。
3. 將樣品浸入0.3% NaNO 在0.3% NaNO 溶液中室溫浸泡20分鐘以誘導(dǎo)MMb形成。研磨后的樣品可置于小篩網(wǎng)上，以幫助降低和提升立方體，同時(shí)盡量減少碎裂。
4. 從燒杯中取出樣品，用布擦去多余的溶液。 盡可能保留三維形狀，并將用于評(píng)價(jià)的表面放入 不透水的袋中并真空包裝（真空度均勻）。真空可能會(huì) 稍微壓平或圓化樣品 。
5. 立即掃描400至700 nm的反射率，以確定 表面形成的MMb的初始量 。 保持表面完整性 。
6. 將樣品置于30°C的培養(yǎng)箱中 ，2小時(shí)后重新掃描以測(cè)定MMb的剩余量。
計(jì)算
%MMb =[ K/S 572÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 572÷ K/S 525
（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（100% MMb）][ ×100 ]。
MRA（MMb減少的百分比） =[（初始%MMb−最終%MMb）÷初始%MMb]×100 或?qū)⒊跏糓Mb作為 MRA 的指標(biāo)（見(jiàn)下文注釋?zhuān)?br />
記下
部分研究者（McKenna等，2005；Mancini等，2008）指出，亞硝酸鈉溶液中氧化反應(yīng)生成的MMb初始量可作為樣本 MRA 的良好指標(biāo)。但King等（2011）發(fā)現(xiàn)，MMb的還原百分比比其初始生成量更具參考價(jià)值。因此，建議同時(shí)采集并統(tǒng)計(jì)分析MMb的初始生成量及其在孵育過(guò)程中的還原百分比。
參考文獻(xiàn)
King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測(cè)量時(shí)間對(duì)肌紅蛋白還原活性和耗氧量
與長(zhǎng)肌肉色穩(wěn)定性儀器測(cè)量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。曼奇尼，R.A.、M.塞弗特和M.C.亨特。2008年。數(shù)據(jù)表達(dá)、樣本位置和氧分壓對(duì)牛肉肌肉中一氧化氮高鐵肌紅蛋白形成和高鐵肌紅蛋白還原活性測(cè)量的影響。肉類(lèi)科學(xué) 79 ：244—251。
McKenna，D. R.，P. D. Mies，B. E. Baird，K. D. Pfeiffer，J. W. Ellebracht，and J. W. Savell. 2005.影響19種牛肌肉變色特征的生化和物理因素。Meat Sci. 70 ：665—682。
Mohan，A.，S. Muthukrishnan，M. C. Hunt，T. J. Barstow，and T. A. Houser. 2010d.蘋(píng)果酸脫氫酶還原高鐵肌紅蛋白的動(dòng)力學(xué)。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志58：6994— 7000 。
雷恩斯，C.R.、M.C.亨特和J.A.昂魯，2010年。不同顏色穩(wěn)定性的肌肉對(duì)牛肉整體顏色穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)。食品科學(xué)雜志 75 ：C85-C89。
Sammel，L. M.，M. C. Hunt，D. H. Kropf，K. A. Hachmeister，C. L. Kastner，and D. E. Johnson. 2002b. 肉牛半膜肌內(nèi)外化學(xué)特性對(duì)顏色性狀的影響 . J. Food Sci. 67 ： 1323 — 1330 .
瓦茨、B. M.、J. 克倫德、M. W. 希普瑟、B. 哈欽斯和B. 薩利赫。1966年。肉類(lèi)中的酶還原途徑。J. 食品科學(xué) 32 ：855-862。
原則：
純化肌紅蛋白有時(shí)是必要的，例如用于比較 不同物種 肌紅蛋白（Mb）的自氧化速率。 肌紅蛋白（分子量 約 16,949）可以從骨骼肌或心肌中輕松純化 。其紅色便于在層析過(guò)程中直觀觀察。該方法使用相對(duì)廉價(jià)的設(shè)備即可獲得較高產(chǎn)率的肌紅蛋白（Faustman和Phillips，2001；改編自Wittenberg和Wittenberg，1981年以及Trout和Gutzke，1996年的早期方法）。
樣品、試劑和溶液
1. 去脂去筋的牛肉塊
2. 均質(zhì)化緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
3. 氫氧化鈉
4. 硫酸銨
5. 透析緩沖液（10 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.0）在4 °C
6. 色譜洗脫緩沖液（5 mM Tris-Cl/1 mM EDTA，pH 8.5）在4 °C
記下
為了將亞鐵肌紅蛋白的形成降至最低，均質(zhì)化和所有后續(xù)步驟應(yīng)在0至5 ° C和高pH（8.0至8.5）下進(jìn)行。
設(shè)備
攪拌器、紗布、 4℃ 下 20,000×g 轉(zhuǎn)速離心機(jī)、透析管（分子量截留值12 ，000至14 ，000）、 Sephracryl S - 200HR色譜柱（30× 2.5至cm）、蠕動(dòng)泵。需要額外試劑和設(shè)備來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，或 基于其消光系數(shù)計(jì)算肌紅蛋白濃度 。
制備勻漿
1. 將150克切碎的肌肉與450毫升勻漿緩沖液放入攪拌機(jī)中進(jìn)行勻漿處理高速運(yùn)轉(zhuǎn)1至2分鐘。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中， 在4℃ 下以3000× g 離心10分鐘。
3. 棄去池上清液， 用氫氧化鈉 調(diào)節(jié)所得上清液的pH至8.0。
4. 用兩層紗布過(guò)濾上清液，以去除脂質(zhì)和結(jié)締組織顆粒。
沉淀肌紅蛋白
1. 將濾液飽和至70%硫酸銨濃度（472克硫酸銨/升濾液），用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0，
攪拌1小時(shí)。
2. 將勻漿液均等分裝至各試管中，4℃條件下以18,000× g 離心20分鐘，去除沉淀蛋白。
3. 合并上清液，棄去沉淀。
4. 將上清液從70%濃度調(diào)整至100%硫酸銨飽和度（通過(guò)添加（上清液中額外添加228克硫酸銨/L），用 氫氧化鈉 調(diào)節(jié)pH至8.0， 并攪拌1小時(shí) 。
5. 將勻漿液均分至各試管中，隨后以1000×g離心1小時(shí)。20,000 × g ，4 ° C。棄去上清液，加入1或2 mL冰冷卻緩沖液以幫助沉淀物的回收。
透析和純化肌紅蛋白
1. 將沉淀的肌紅蛋白轉(zhuǎn)移至透析管中，并在4 ° C下使用透析緩沖液（1體積蛋白質(zhì)，10體積緩沖液）透析24小時(shí)，每8小時(shí)更換緩沖液。
2. 使用蠕動(dòng)泵 ，用色譜洗脫 緩沖液（3個(gè)色譜柱體積）平衡Sephacryl S-200 HR色譜柱。
3. 將透析液加入色譜柱，以60mL/小時(shí)的流速用色譜洗脫緩沖液洗脫肌紅蛋白提取物。該步驟將血紅蛋白與肌紅蛋白分離。血紅蛋白將首先洗脫為淡紅色/棕色條帶。肌紅蛋白隨后作為 明顯可見(jiàn)的深紅色條帶洗脫。
4. 使用分餾收集器收集含肌紅蛋白的餾分。
肌紅蛋白濃縮物
1. 將所有含肌紅蛋白的組分進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用天然聚丙烯酰胺凝膠電泳法可評(píng)估肌紅蛋白提取物的純度， 該提取物應(yīng)產(chǎn)生一條分子量為17kDa的單一蛋白條帶 。
2. 使用離心濃縮器濃縮肌紅蛋白溶液。
3. 或者（步驟2的替代方案），將肌紅蛋白溶液飽和至100%硫酸銨濃度（761克硫酸銨/升溶液），將pH調(diào)節(jié)至8.0，攪拌溶液1 小時(shí) 。 將溶液均分至各試管中，并在4°C下以20,000×g離心1小時(shí) ， 000×g g 。 排棄上清液，并按前述方法透析肌紅蛋白 。
4. 或者（步驟2和3），肌紅蛋白可通過(guò) Trout和Gutzke（1996）所述 的超濾法濃縮。
5. 測(cè)定肌紅蛋白溶液的蛋白質(zhì)濃度，并分裝至 -80℃ 冷凍保存。
記下
這種肌紅蛋白分離程序的產(chǎn)量相對(duì)較低，需要2到3個(gè)月的 收集才能得到大量的 肌紅蛋白。
參考文獻(xiàn)
Faustman，C.和A. Phillips. 2001.新鮮肉變色的測(cè)量. 《食品分析化學(xué)最新協(xié)議》 第F3.3單元，S.J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.，紐約。
特勞特，G.R.和D.A.古茲克。1996年。一種簡(jiǎn)單、快速的制備方法，用于分離和純化氧肌紅蛋白。肉類(lèi)科學(xué)43 ：1- 13 。
Wittenberg，J. B.和B. A. Wittenberg. 1981.肌紅蛋白的制備. Methods Enzymol. 76 ：29–42.
H.從牛骨骼肌中分離線粒體
原則
線粒體分離包含三個(gè)步驟：細(xì)胞裂解、勻漿和離心。使用蛋白酶處理骨骼肌可顯著促進(jìn)線粒體釋放，同時(shí)提高產(chǎn)量。
試劑
1. 1 M蔗糖：將342.3 g蔗糖溶于1 L蒸餾水中，混勻，分裝成20 mL等分試樣， 于-20℃ 保存。
2. 0.1 M Tris/MOPS：將12.1克Tris[三（羥甲基）氨基甲烷]溶解于500 mL 蒸餾水中 ， 調(diào)節(jié)pH 至7 。 使用MOPS [ 3 -（N -嗎啉代）丙磺酸]粉末，將溶液定容至1 L，并于4 ° C保存。
3. 1 M Tris/鹽酸：將121.14 g Tris溶于500 mL蒸餾水中， 用鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4 ， 將溶液稀釋至1 L并室溫保存 。
4. 1 M EDTA：將372.2 g EDTA（乙二胺四乙酸）溶于500 mL 蒸餾水中，并于4℃保存 。
5. 10% BSA：將10 g BSA（牛血清白蛋白）溶于100 mL蒸餾水中， 存放于-20℃ 。
7. 10mMEDTA：將2.92gEDTA溶于1L蒸餾水中，并于4℃ 保存 。
8. 0.5%BSA：將5 g BSA溶于1 L蒸餾水中，并于-20 °C 下保存。
9. 納加酶：配制20毫克/100毫升分離液濃度的納加酶溶液（即20毫克/100毫升）。
重要提示： 其他蛋白酶（胰蛋白酶）的選擇取決于研究者偏好和方案，以及用于分離線粒體
的肌肉類(lèi)型。
關(guān)鍵步驟3： 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天制備所有緩沖液，以避免儲(chǔ)存的緩沖液中細(xì)菌/酵母生長(zhǎng)。
關(guān)鍵步驟4： 由于pH值取決于溫度，所有溶液的pH值都應(yīng)在25°C時(shí)測(cè)量。
操作步驟
1. 取5克（精確至0.1克）目標(biāo)肌肉組織樣本，確保不含可見(jiàn)脂肪或結(jié)締組織，隨后切成小塊。
2. 取小燒杯，將肌肉組織浸入20毫升冰浴PBS（磷酸鹽緩沖液）中，其中添加了10 mM EDTA。
3. 用剪刀把肌肉切成小塊。
4. 用含10 mM EDTA的冰凍PBS緩沖液對(duì)碎肌肉進(jìn)行2-3次清洗。
5. 將切碎的肌肉重新懸浮于5毫升冰凍的含10 mM EDTA的PBS溶液中。
6. 以200 × g 離心5分鐘，棄去上清液。
重要提示： 組織與分離緩沖液的最佳比例范圍為1：5 至1：10（w/v）。
8. 使用 以1 600 rpm 轉(zhuǎn)速運(yùn)行的Teflon杵的Potter-Elvehjem研磨器均質(zhì)化肌肉組織； 將均質(zhì)化的肌肉搗碎10至20次 。
重要提示： 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前5分鐘將玻璃器皿置于冰浴中預(yù)冷。勻漿及后續(xù)步驟必須在4 ℃下進(jìn)行,以盡量減少磷脂酶和蛋白酶的激活，從而避免對(duì)肌肉造成損傷。
9. 將勻漿液轉(zhuǎn)移至50 mL聚丙烯Falcon管中， 在4℃下以700× g 離心 10分鐘 。
10. 將上清液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中， 4℃ 以8000× g 離心10分鐘。
14. 使用Biuret/Bradford法中的一種方法測(cè)定線粒體濃度Bicinchoninic Acid assay（BCA）法。
參考文獻(xiàn)
Bhattacharya，S. K.，J. H. Thakar，P. L. Johnson和D. R. Shanklin. 1991.使用含有EDTA和Nagarse的離子介質(zhì)從
倉(cāng)鼠中分離骨骼肌線粒體。分析生物化學(xué)192： 344 — 349 。
Frezza，C.，S. Cipolat，and L. Scorrano. 2007 .小鼠肝臟、肌肉 和培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中線粒體的分離與功能。
Nat. Protoc. 2： 287 —295。
Mohan，A.，M. C. Hunt，S. Muthukrishnan，T. A. Houser和T. E. Barstow. 2010c. 分區(qū)乳酸和蘋(píng)果酸脫氫酶對(duì)
肌紅蛋白氧化還原形式穩(wěn)定性的研究。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志58： 7021 — 7029 。
i. 完整肌肉或絞肉的耗氧量
原則
新鮮切割的肉片需經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的氧氣處理（即讓其充分氧化），隨后進(jìn)行真空包裝。通過(guò)酶呼吸作用導(dǎo)致的氧化肌肉組織（OMb）減少量，可作為 衡量組織 氧氣消耗能力 的 指標(biāo) 。 在25℃水浴或培養(yǎng)箱中 ， 立即記錄400-700納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的反射光譜 ，并在20分鐘后再次測(cè)量。 氧化肌紅蛋白水平通過(guò) K / S 轉(zhuǎn)換公式計(jì)算得出，具體方法詳見(jiàn)第九節(jié)。 K / S 610/ K / S 525比值越高，表明OMb含量越高。氧氣消耗量（OC）以 首次與末次測(cè)量的百分比差異 形式呈現(xiàn)。
設(shè)備和用品
1. 真空包裝機(jī)
2. 聚氯乙烯薄膜
4. 能掃描并記錄400至700 nm表面反射率的分光光度計(jì)（見(jiàn) 第IX節(jié)）
操作步驟
1. 例如，所有待測(cè)樣品必須處于相同溫度（4 ° C）下，否則溫度越高，樣本的耗氧量越快，而藻華發(fā)育（即富氧）則越慢；溫度越低，耗氧量越慢，藻華發(fā)育則越快。
2. 為確保氧氣供應(yīng)均勻，所有樣本需保存在 2-4℃ 的環(huán)境中。對(duì)于完整 肌肉樣本 ，應(yīng)用鋒利刀具切取3厘米×3厘米×2厘米的樣本塊 ，盡量去除可見(jiàn)脂肪和結(jié)締組織。研磨樣本則需準(zhǔn)備體積相當(dāng)?shù)木鶆驂簩?shí)立方體，其可見(jiàn)脂肪含量應(yīng)與樣本瘦肉部分的典型水平相當(dāng)。切記使用鈍刀具，以免破壞表面結(jié)構(gòu)。同時(shí)避免對(duì)研磨樣本的表面進(jìn)行過(guò)度操作或擠壓（參見(jiàn)Madhavi和 Carpenter ， 1993 年研究）。
3. 如果表面不是新鮮的切割面，那么在開(kāi)始開(kāi)花步驟之前， 只需去除一層薄薄的表面層，以暴露新鮮的組織 。
4. 用一小塊透氣膜覆蓋新切面，防止干燥。將聚氯乙烯膜（常用）平鋪一層，確保表面均勻接觸空氣。記錄膜的透氣性。
5. 在2至4 °C（或其他標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間）下進(jìn)行2小時(shí)的顯色。注意使所有樣品在該步驟中保持相同的溫度，因?yàn)轱@色非常依賴(lài)于溫度。
6. 花開(kāi)后 ， 去除聚氯乙烯薄膜并將樣品放入氧氣滲透性極低的袋中 。用高真空快速真空包裝；保持樣品間的真空均勻。
7. 立即掃描樣品表面，以 測(cè)定400至700nm范圍內(nèi)的反射率 ，從而 確定初始OMb 。 光譜儀必須通過(guò) 真空袋薄膜進(jìn)行校準(zhǔn)。
8. 為加快氧氣消耗，使用25 ° C的培養(yǎng)箱或水浴。20分鐘后（或根據(jù)所用肉類(lèi)的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間）重新掃描同一表面。
計(jì)算
%OMb =[ K/S 610÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 610÷ K/S 525（100%
DMb）]-[ K/S 610÷ K/S 525（100% OMb）][ ×100 ]。
氧消耗量 = [（初始OMb%−最終OMb%）÷初始OMb%]×100。
記下
馬達(dá)維和卡彭特（1993年）提出了一種利用反射光譜儀測(cè)量氧氣消耗量（OC）的檢測(cè)方法。該方法通過(guò)配備反射光譜附件的分光光度計(jì)， 首先對(duì)真空包裝樣品的表面有機(jī)物（OMb）含量 進(jìn)行測(cè)定， 并以5分鐘 為間隔（總計(jì)20分鐘）在4℃ 條件下重復(fù)測(cè)量。 樣品尺寸經(jīng)過(guò)調(diào)整（2.5×2.5×0.5厘米）以適應(yīng)反射光譜儀的樣品接口。有機(jī)物的相對(duì)濃度采用克日維茨基（1979年）的方法計(jì)算，但唐等人（2004年）對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，并推薦了 修訂后的波長(zhǎng)參數(shù)（詳見(jiàn)第九節(jié)）。 氧氣消耗量以百分比形式表示 ，即 真空包裝樣品在10分鐘內(nèi)消耗的初始表面有機(jī)物量 。
Mancini、Hunt和Kropf（2003）報(bào)告了一種使用610nm反射率直接測(cè)定OMb 的方法。這是可能的，因?yàn)镺Mb在610nm處具有其獨(dú)特的反射率，而610nm 對(duì)DMb和MMb都是等滲的（關(guān)于肉表面反射率測(cè)量和 K/S 比率 的進(jìn)一步討論，參見(jiàn)第IX節(jié)）。 該方法已成功使用（參見(jiàn)King等人 ， 2011）。
部分研究采用單位時(shí)間內(nèi)有機(jī)物（OMb）百分比變化值來(lái)報(bào)告實(shí)際“耗氧量”，但這種方法操作繁瑣且耗時(shí)。對(duì)于大量樣本，通常將“耗氧量”計(jì)算為樣本初始有機(jī)物含量的“平均百分比降幅”。 樣本脫氧時(shí)間需標(biāo)準(zhǔn)化 ， 通常 20分鐘即可檢測(cè)出樣本差異 。
參考文獻(xiàn)
King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測(cè)量時(shí)間對(duì)肌紅蛋白還原活性和耗氧量
與長(zhǎng)肌肉色穩(wěn)定性儀器測(cè)量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 —942。
曼奇尼 ，R . A .，M . C . 亨特 ，和D . H . 克羅普 .2003. 610納米反射率估計(jì)牛肉表面的氧合血紅蛋白含量 . Meat Sci . 64 ：157— 162 .
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過(guò)近紅外血氧測(cè)定法檢測(cè)三種后強(qiáng)直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。
唐，J.，C.福斯特曼，和T. A.霍格蘭。2004年。重新審視克日維茨基，水性肉類(lèi)提取物中肌紅蛋白氧化還原形式分光光度測(cè)定的方程式。食品科學(xué)雜志69： C717 — C720 。
J.完整肉或碎肉的肌紅蛋白還原能力
原則
首先將樣本切片浸入稀硝酸鈉溶液中浸泡20分鐘，使表面色素氧化生成甲基甲基藍(lán)（MMb） 。隨后將切片（厚度1.27厘米）真空包裝，在30℃環(huán)境下通過(guò)測(cè)量 K/S 比值 （572/525納米波長(zhǎng)）持續(xù)監(jiān)測(cè)表面MMb含量2小時(shí)。樣品的還原能力定義為培養(yǎng)期間 表面MMb濃度的百分比降幅。MMb濃度的下降程度可視為組織還原鐵血紅素鐵 能力的反映。
試劑
1. 0.3%（w/w）亞硝酸鈉溶液：稱(chēng)取大燒杯，稱(chēng)取 3.0 g NaNO 2 加入燒杯中，加蒸餾水至1000克，每日新鮮配制，室溫孵育。
操作步驟
1. 取一塊3cm×3cm×2cm的肌肉組織樣本（無(wú)可見(jiàn)脂肪或結(jié)締組織），若使用絞肉則取一塊大小相近且緊密壓實(shí)的樣本，以防止樣本浸入時(shí)碎裂。
2. 務(wù)必先對(duì)樣本進(jìn)行定位，以便確定后續(xù)要評(píng)估的表面。該表面可能是新切面，也可能是展示過(guò)的表面。
3. 將樣品浸入0.3% NaNO 在0.3% NaNO 溶液中室溫浸泡20分鐘以誘導(dǎo)MMb形成。研磨后的樣品可置于小篩網(wǎng)上，以幫助降低和提升立方體，同時(shí)盡量減少碎裂。
4. 從燒杯中取出樣品，用布擦去多余的溶液。 盡可能保留三維形狀，并將用于評(píng)價(jià)的表面放入 不透水的袋中并真空包裝（真空度均勻）。真空可能會(huì) 稍微壓平或圓化樣品 。
5. 立即掃描400至700 nm的反射率，以確定 表面形成的MMb的初始量 。 保持表面完整性 。
6. 將樣品置于30°C的培養(yǎng)箱中 ，2小時(shí)后重新掃描以測(cè)定MMb的剩余量。
計(jì)算
%MMb =[ K/S 572÷ K/S 525（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（樣品）]÷[ K/S 572÷ K/S 525
（100%DMb）]-[ K/S 572÷ K/S 525（100% MMb）][ ×100 ]。
MRA（MMb減少的百分比） =[（初始%MMb−最終%MMb）÷初始%MMb]×100 或?qū)⒊跏糓Mb作為 MRA 的指標(biāo)（見(jiàn)下文注釋?zhuān)?br />
記下
部分研究者（McKenna等，2005；Mancini等，2008）指出，亞硝酸鈉溶液中氧化反應(yīng)生成的MMb初始量可作為樣本 MRA 的良好指標(biāo)。但King等（2011）發(fā)現(xiàn)，MMb的還原百分比比其初始生成量更具參考價(jià)值。因此，建議同時(shí)采集并統(tǒng)計(jì)分析MMb的初始生成量及其在孵育過(guò)程中的還原百分比。
參考文獻(xiàn)
King，D. A.，S. D. Shackelford，A. B. Rodriguez和T. L. Wheeler. 2011.測(cè)量時(shí)間對(duì)肌紅蛋白還原活性和耗氧量
與長(zhǎng)肌肉色穩(wěn)定性儀器測(cè)量值之間關(guān)系的影響。Meat Sci. 87 ：26— 32 。曼奇尼，R.A.、M.塞弗特和M.C.亨特。2008年。數(shù)據(jù)表達(dá)、樣本位置和氧分壓對(duì)牛肉肌肉中一氧化氮高鐵肌紅蛋白形成和高鐵肌紅蛋白還原活性測(cè)量的影響。肉類(lèi)科學(xué) 79 ：244—251。
McKenna，D. R.，P. D. Mies，B. E. Baird，K. D. Pfeiffer，J. W. Ellebracht，and J. W. Savell. 2005.影響19種牛肌肉變色特征的生化和物理因素。Meat Sci. 70 ：665—682。
Mohan，A.，S. Muthukrishnan，M. C. Hunt，T. J. Barstow，and T. A. Houser. 2010d.蘋(píng)果酸脫氫酶還原高鐵肌紅蛋白的動(dòng)力學(xué)。農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)雜志58：6994— 7000 。
雷恩斯，C.R.、M.C.亨特和J.A.昂魯，2010年。不同顏色穩(wěn)定性的肌肉對(duì)牛肉整體顏色穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)。食品科學(xué)雜志 75 ：C85-C89。
Sammel，L. M.，M. C. Hunt，D. H. Kropf，K. A. Hachmeister，C. L. Kastner，and D. E. Johnson. 2002b. 肉牛半膜肌內(nèi)外化學(xué)特性對(duì)顏色性狀的影響 . J. Food Sci. 67 ： 1323 — 1330 .
瓦茨、B. M.、J. 克倫德、M. W. 希普瑟、B. 哈欽斯和B. 薩利赫。1966年。肉類(lèi)中的酶還原途徑。J. 食品科學(xué) 32 ：855-862。
標(biāo)簽：
肉質(zhì)新鮮度測(cè)定儀
肉質(zhì)成分測(cè)定儀
- 神經(jīng)科學(xué)研究中利用激光多普勒與激光散斑成像精準(zhǔn)捕捉微循環(huán)的變化
- 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為分析助力中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）新藥研發(fā)突破瓶頸
- 輻照平臺(tái)助力小細(xì)胞肺癌三聯(lián)療法研究：PARPi 聯(lián)合放療與免疫治療機(jī)制
- 體成分分析研究案例：衰老及調(diào)控膳食血糖對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響
- 腸腦軸新機(jī)制的研究：揭秘衰老認(rèn)知下降的腸道誘因
- 輻照儀應(yīng)用案例：靶向Nrf2通路護(hù)腸道，解碼外泌體放療防護(hù)機(jī)制
- 利用微血管結(jié)構(gòu)與血流動(dòng)力學(xué)分析助力皮膚微循環(huán)研究
- 神經(jīng)科學(xué)與行為學(xué)研究：利用籠居行為監(jiān)測(cè)解密實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
- 瑞沃德重磅直播，聚焦腫瘤代謝與靶向治療
- 康森特春季招聘：誠(chéng)招技術(shù)營(yíng)銷(xiāo)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員
- 桂寧（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司誠(chéng)聘技術(shù)支持工程師
- 聚焦肺部給藥新未來(lái)，慧榮和亮相DDL 2025國(guó)際舞臺(tái)
- 打破常規(guī)：德伯科技推出預(yù)裝型香煙煙霧發(fā)生器CM20C
- 慧榮和亮相中國(guó)毒理學(xué)會(huì)農(nóng)藥毒理學(xué)專(zhuān)委會(huì)成立大會(huì)
- 瑞沃德23周年慶典直播來(lái)襲，千元紅包面試直通等你來(lái)
- 慧榮和精彩亮相遼寧省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2025年學(xué)術(shù)年會(huì)
Copyright(C) 1998-2026 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com