ChIP-seq等揭示大豆開花時間調控及區(qū)域適應性的表觀分子機制
近日，華南農業(yè)大學生命科學學院王應祥課題組和華南農業(yè)大學農學院楊存義課題組合作探究了大豆開花進程的調控機制，特別是組蛋白去甲基化酶GmLDL2（Lysine-specific demethylase like 2）在大豆適應低緯度地區(qū)中的作用。具體而言，研究者通過篩選早花突變體ef1并鑒定其因果基因GmLDL2，結合ChIP-seq和RNA-seq等分析，揭示了GmLDL2通過直接調控下游靶基因GmFER（擬南芥FERONIA直系同源物）的表達來調控大豆開花進程，進而影響大豆在不同緯度地區(qū)的適應性。這一發(fā)現(xiàn)為通過分子設計育種改善大豆區(qū)域適應性提供了重要的理論基礎和潛在靶點。相關研究成果以“Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean”為題發(fā)表于《Nature Communications》（自然通訊）。
標題：Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean（組蛋白去甲基化酶GmLDL2自然變異調控大豆開花時間分化和地理適應性）
發(fā)表時間：2025年7月1日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術）
作者單位：華南農業(yè)大學
DOI：10.1038/s41467-025-61328-6
在適當?shù)臅r間開花是決定大豆區(qū)域適應性和產量的關鍵性狀之一。此前，盡管已在大豆中鑒定出幾個調控開花時間的關鍵基因，但相關表觀遺傳調控因子尚不完全清楚。本研究鑒定出一個早花突變體（ef1），并克隆其“因果”基因GmLDL2。其中，酶活性實驗表明，GmLDL2對H3K4me1和H3K4me2（H3K4me1/2）具有去甲基化活性。ChIP-seq和RNA-seq整合分析表明，GmLDL2直接抑制大豆FERONIA同源基因GmFER表達。遺傳分析揭示GmLDL2以GmFER依賴性方式調控大豆開花。GmLDL2兩種單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2表現(xiàn)出差異去甲基化活性，可能分別促進大豆對低緯度和高緯度地區(qū)適應性�？傊�，本研究發(fā)現(xiàn)揭示了GmLDL2-GmFER模塊在調控大豆開花中的作用，并為改良大豆的區(qū)域適應性補充了關鍵信息。
圖形摘要：GmLDL2在調控大豆開花時間和提高低緯度適應性中的作用模型
在自然選擇下，GmLDL2H1等位基因促進大豆在低緯度地區(qū)適應；在人工選擇下，GmLDL2H2等位基因促進大豆在高緯度地區(qū)適應。GmLDL2通過改變GmFER基因位點上的H3K4甲基化狀態(tài)抑制GmFER表達，進而調控開花時間。
研究方法
（1）早花大豆突變體ef1篩選與并因果基因鑒定
通過60Co γ射線誘變HX3，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的早花突變體ef1，ef1在短日照（SD）和長日照（LD）條件下均表現(xiàn)出顯著早花。通過圖位克隆技術，將ef1基因定位到第6染色體的一個0.5 Mb區(qū)域，并最終鑒定出GmLDL2基因。GmLDL2基因編碼一個與擬南芥組蛋白去甲基化酶LDL2同源的蛋白，ef1突變體中GmLDL2基因的第一外顯子存在1 bp缺失，導致移碼突變和提前終止，產生截短蛋白（圖1h）。這一結果為后續(xù)研究提供了基礎。
b. 短日照（SD,11h光照/13h黑暗）和長日照（LD,15h光照/9h黑暗）條件下，HX3和ef1開花時間。
c. 在廣州夏季的田間條件下，HX3和ef1的成熟時間。
d. 在田間條件下，全年播種日期與HX3和ef1開花時間的關系。
e. 在田間條件下，HX3與ef1雜交的F2代開花時間頻率分布。
f. 沿染色體的SNP指數(shù)分布。
g. 廣東農家品種LNHM與ef1的F2群體進行ef1的精細定位。
h. AtLDL2和GmLDL2的比較。粉色和灰色方塊分別代表SWRIM和胺氧化酶結構域。
（2）驗證GmLDL2在調控大豆開花中的功能
為了驗證GmLDL2的功能，研究者將GmLDL2基因的編碼序列（CDS）在ef1突變體背景下過表達。轉基因植株開花時間延遲，證實了GmLDL2是ef1突變體早期開花的因果基因。此外，利用CRISPR/Cas9技術在HX3背景中敲除GmLDL2基因，生成了兩個Gmldl2突變體Gmldl2-2和Gmldl2-3，它們均表現(xiàn)出早花表型，進一步驗證GmLDL2的功能。這些結果表明GmLDL2在大豆開花調控中起著關鍵作用。
b. 在短日照和長日照條件下，HX3、ef1和兩個GmLDL2過表達轉基因系的開花時間。
c. 敲除GmLDL2的CRISPR/Cas9的sgRNA設計。
d. HX3和Gmldl2突變體中GmLDL2的預測氨基酸序列。
e. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3的植株和花朵的表型。與HX3相比，ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3開花更早。
f. 在短日照和長日照條件下，所有受檢品種的開花時間。
g-h. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3在ZT4時GmFT2a和GmFT5a的表達水平。
（3）GmLDL2的組蛋白去甲基化酶活性測定
通過體外實驗，研究者發(fā)現(xiàn)GmLDL2對H3K4me1和H3K4me2具有去甲基化活性，但對H3K4me3、H3K9me2、H3K27me1或H3K36me3沒有活性。在煙草葉片中瞬時表達GmLDL2，并檢測其對組蛋白修飾的影響，發(fā)現(xiàn)GmLDL2顯著降低了H3K4me1和H3K4me2的信號水平。這些結果表明GmLDL2是一個特異性H3K4去甲基化酶，可能通過調控H3K4me1和H3K4me2水平來作用基因表達。
b. 使用ImageJ對（a）進行定量分析。
c. GmLDL2-GFP在本氏煙（N.benthamiana）葉片中顯示出H3K4me1/2去甲基化活性。
d. 對（c）中的熒光信號水平進行統(tǒng)計分析。
（4）GmLDL2介導基因表達的轉錄組分析
對HX3和ef1的葉片進行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)與HX3相比，ef1中有440個基因上調和372個基因下調。GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調基因主要參與激酶活性、轉移酶活性、DNA結合轉錄因子活性和轉錄調控活性，而下調基因主要富集在分子功能、結合、細胞外區(qū)域和細胞壁功能。KEGG分析顯示，上調基因與脂肪酸代謝、亞油酸代謝、單萜生物合成等通路相關，而下調基因主要富集在異喹啉生物堿代謝、檸檬烯和蒎烯降解等通路。這些結果表明GmLDL2可能通過調控這些基因的表達來影響大豆的開花時間和適應性。
b-c. 分別在ef1中上調的440個基因或下調的372個基因中富集的GO分析。外圈表示GO分類，中圈表示大豆基因組背景中每個GO基因數(shù)量，內圈表示差異表達基因的數(shù)量。
d. HX3和ef1中已知開花調控基因的表達譜熱圖。
（5）GmLDL2結合位點的ChIP-seq分析
利用ChIP-seq技術，研究者鑒定出GmLDL2在全基因組范圍內的結合位點。通過抗GmLDL2抗體進行ChIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2結合位點主要分布在基因區(qū)域，尤其是基因下游區(qū)域。分析H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的分布模式，發(fā)現(xiàn)它們在基因區(qū)域的分布模式不同，H3K4me1和H3K4me2在基因下游區(qū)域的水平較高。這些結果表明GmLDL2可能通過結合特定基因區(qū)域并調控H3K4me1和H3K4me2的水平來影響基因表達。ChIP-seq分析還揭示了GmLDL2結合位點與基因表達水平之間的相關性，為后續(xù)研究提供了重要的線索。
b. 在HX3和ef1中，根據(jù)表達水平分為三組基因的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的reads分布。將genebody區(qū)域劃分為等分區(qū)間，以10 bp滑動窗口計算TSS上游1.5 kb和TES下游reads分布。Metaplots表示每組基因的歸一化reads分布平均值。熱圖顯示所有基因的reads分布。每組基因按基因表達水平（FPKM）從高到低排序。TSS表示轉錄起始位點，TES表示轉錄終止位點。
c. 在ef1中上調基因、ef1中H3K4me1/2高甲基化基因以及GmLDL2結合基因間的重疊維恩圖。
d. HX3和ef1中GmFER位點的RNA-seq、抗GmLDL2、抗H3K4me1和抗H3K4me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)的基因組軌跡。
e. GmFER表達水平的qRT-PCR分析。
f-g. GmFER位點的H3K4me1和H3K4me2甲基化狀態(tài)的ChIP-qPCR分析。
h. GmLDL2與GmFER位點結合的ChIP-qPCR分析。
（6）鑒定GmLDL2的特定靶基因
結合RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)，研究者鑒定出GmLDL2的特定靶基因GmFER。GmFER基因與擬南芥FERONIA基因同源，其在ef1中的表達顯著上調，并且GmLDL2結合位點的H3K4me1和H3K4me2水平增加。通過RT-qPCR和ChIP-qPCR驗證GmFER在ef1中表達上調，且GmLDL2結合位點的H3K4me1和H3K4me2水平增加。這些結果表明GmLDL2通過直接結合GmFER基因并調控其H3K4me1和H3K4me2水平來抑制其表達，進而調控大豆的開花時間。
（7）GmLDL2通過GmFER依賴性方式負向調控大豆開花
在擬南芥中過表達GmFER，發(fā)現(xiàn)開花時間提前，表明GmFER在開花調控中發(fā)揮促進作用。在大豆中過表達GmFER，同樣發(fā)現(xiàn)開花時間提前。通過CRISPR/Cas9技術在Gmldl2突變體背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer雙突變體，發(fā)現(xiàn)雙突變體開花時間延遲。這些結果表明GmLDL2通過GmFER依賴性方式負向調控大豆開花，揭示了GmLDL2-GmFER模塊在大豆開花時間調控中的重要作用。
b. HX3和GmFER-OE轉基因植株中GmFER的表達水平。。
c. 使用抗Flag抗體的western blot驗證GmFER-OE轉基因植株中GmFER的表達。
d. 在短日照和長日照條件下，HX3和GmFER-OE植株的開花時間。
e. 在Gmldl2突變體背景下，敲除GmFER的CRISPR/Cas9的sgRNA設計。
f. HX3和Gmldl2/fer雙突變體中GmLDL2和GmFER的預測氨基酸序列。
g. 在長日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2/fer和Gmldl2-3/fer的植株和花朵表型。與ef1相比，所有Gmldl2/fer雙突變體開花更晚。
h. 在短日照和長日照條件下，所有受檢品種的開花時間。
（8）不同的GmLDL2等位基因促進大豆區(qū)域適應性
通過對2898份大豆品種的全基因組重測序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2基因存在兩種主要單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2。GmLDL2H1在低緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高，而GmLDL2H2在高緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高。這兩種單倍型的GmLDL2在H3K4me2的去甲基化活性上存在顯著差異，GmLDL2H1的活性高于GmLDL2H2（圖7d-g）。這些結果表明GmLDL2的不同等位基因可能通過調控GmFER表達水平來影響大豆的開花時間和區(qū)域適應性。
b. 在三個種質群體中，GmLDL2單倍型比例。
c. 在中國，攜帶GmLDL2H1和GmLDL2H2栽培品種的地理分布。NE表示中國東北地區(qū)；NR表示中國北部地區(qū)；HR表示中國黃淮地區(qū)；SR表示中國南方地區(qū)。
d. 在本氏煙葉片中對GmLDL2H1和GmLDL2H2的去甲基化活性進行測定。
e. 對(d)中的熒光信號強度進行的統(tǒng)計分析。
f. H3K4me1/2去甲基化活性測定，使用特異性甲基化抗體確定組蛋白的甲基化狀態(tài)。
g. 使用ImageJ對(f)進行的定量分析。
h–j. 在廣州和三亞的自然短日照條件下，攜帶GmLDL2H1（n=18個品種）和GmLDL2H2（n=46個品種）的大豆品種的開花時間、株高和粒重統(tǒng)計情況。
結論和啟示
本研究揭示了GmLDL2在大豆開花進程調控中的重要作用，特別是其通過直接調控GmFER基因表達來影響大豆的開花時間和區(qū)域適應性。GmLDL2作為一個特異性H3K4去甲基化酶，通過結合GmFER基因并調控其H3K4me1和H3K4me2水平來抑制其表達。這一調控機制獨立于經(jīng)典的EC-E1通路，為理解大豆開花進程調控提供了新的視角。此外，GmLDL2的不同等位基因在大豆適應低緯度和高緯度地區(qū)中分別發(fā)揮作用，表明GmLDL2在大豆馴化和適應性進化中具有重要意義。
ChIP-seq和RNA-seq技術在本研究中發(fā)揮了關鍵作用，不僅幫助鑒定GmLDL2的結合位點和靶基因，還揭示了GmLDL2調控基因表達的分子機制。這些技術的應用為未來類似研究提供了寶貴的經(jīng)驗和參考。
參考文獻：
Liu M, Fang Y, Jiang J, Chen H, Yang B, Xu X, Liu G, Ling C, Dong Z, Yang C, Wang Y. Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5687. doi: 10.1038/s41467-025-61328-6.
標題：Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean（組蛋白去甲基化酶GmLDL2自然變異調控大豆開花時間分化和地理適應性）
發(fā)表時間：2025年7月1日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq等（易基因金牌技術）
作者單位：華南農業(yè)大學
DOI：10.1038/s41467-025-61328-6
在適當?shù)臅r間開花是決定大豆區(qū)域適應性和產量的關鍵性狀之一。此前，盡管已在大豆中鑒定出幾個調控開花時間的關鍵基因，但相關表觀遺傳調控因子尚不完全清楚。本研究鑒定出一個早花突變體（ef1），并克隆其“因果”基因GmLDL2。其中，酶活性實驗表明，GmLDL2對H3K4me1和H3K4me2（H3K4me1/2）具有去甲基化活性。ChIP-seq和RNA-seq整合分析表明，GmLDL2直接抑制大豆FERONIA同源基因GmFER表達。遺傳分析揭示GmLDL2以GmFER依賴性方式調控大豆開花。GmLDL2兩種單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2表現(xiàn)出差異去甲基化活性，可能分別促進大豆對低緯度和高緯度地區(qū)適應性�？傊�，本研究發(fā)現(xiàn)揭示了GmLDL2-GmFER模塊在調控大豆開花中的作用，并為改良大豆的區(qū)域適應性補充了關鍵信息。
圖形摘要：GmLDL2在調控大豆開花時間和提高低緯度適應性中的作用模型
研究方法
- 早花突變體ef1篩選和基因鑒定：誘變大豆品種Huaxia3（HX3），篩選出早期開花突變體ef1。克隆鑒定出GmLDL2基因，該基因編碼擬南芥組蛋白去甲基化酶LDL2同源蛋白。
- GmLDL2功能驗證：在ef1突變體背景下過表達GmLDL2基因，發(fā)現(xiàn)轉基因植株開花時間延遲，證實GmLDL2是ef1突變體早花的因果基因。敲除GmLDL2基因進一步驗證GmLDL2功能。
- GmLDL2組蛋白去甲基化酶活性測定：體外實驗發(fā)現(xiàn)GmLDL2對H3K4me1/2具有去甲基化活性。在煙草葉片中瞬時表達GmLDL2，并檢測其對組蛋白修飾的作用，進一步驗證其去甲基化酶活性。
- 轉錄組分析（RNA-seq）：對HX3（對照組）和ef1（突變組）葉片進行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)ef1中有440個基因上調和372個基因下調。GO和KEGG分析揭示這些差異表達基因的功能富集。
- ChIP-seq：利用ChIP-seq技術鑒定GmLDL2在全基因組范圍內的結合位點，并分析其對組蛋白修飾的作用。發(fā)現(xiàn)GmLDL2結合并調控的基因GmFER，該基因與擬南芥FERONIA基因同源。
- GmLDL2特定靶基因鑒定：結合RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)，鑒定GmLDL2的特定靶基因GmFER。RT-qPCR和ChIP-qPCR驗證GmFER在ef1中表達上調，且GmLDL2結合位點的H3K4me1/2水平增加。
- GmLDL2在開花時間調控中的功能驗證：在擬南芥和大豆中過表達GmFER，發(fā)現(xiàn)開花時間提前。在Gmldl2突變體背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer雙突變體，發(fā)現(xiàn)雙突變體開花時間延遲，進一步驗證GmLDL2通過GmFER調控開花時間。
- GmLDL2等位基因的地理適應性分析：通過對2898份大豆品種的全基因組重測序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2基因存在兩種主要單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2，其在大豆適應低緯度和高緯度地區(qū)中分別發(fā)揮作用。
（1）早花大豆突變體ef1篩選與并因果基因鑒定
通過60Co γ射線誘變HX3，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的早花突變體ef1，ef1在短日照（SD）和長日照（LD）條件下均表現(xiàn)出顯著早花。通過圖位克隆技術，將ef1基因定位到第6染色體的一個0.5 Mb區(qū)域，并最終鑒定出GmLDL2基因。GmLDL2基因編碼一個與擬南芥組蛋白去甲基化酶LDL2同源的蛋白，ef1突變體中GmLDL2基因的第一外顯子存在1 bp缺失，導致移碼突變和提前終止，產生截短蛋白（圖1h）。這一結果為后續(xù)研究提供了基礎。
圖1：通過圖位克隆鑒定ef1基因。
a. 短日照條件下，HX3和ef1植株及花朵表型。ef1比HX3更早花。b. 短日照（SD,11h光照/13h黑暗）和長日照（LD,15h光照/9h黑暗）條件下，HX3和ef1開花時間。
c. 在廣州夏季的田間條件下，HX3和ef1的成熟時間。
d. 在田間條件下，全年播種日期與HX3和ef1開花時間的關系。
e. 在田間條件下，HX3與ef1雜交的F2代開花時間頻率分布。
f. 沿染色體的SNP指數(shù)分布。
g. 廣東農家品種LNHM與ef1的F2群體進行ef1的精細定位。
h. AtLDL2和GmLDL2的比較。粉色和灰色方塊分別代表SWRIM和胺氧化酶結構域。
（2）驗證GmLDL2在調控大豆開花中的功能
為了驗證GmLDL2的功能，研究者將GmLDL2基因的編碼序列（CDS）在ef1突變體背景下過表達。轉基因植株開花時間延遲，證實了GmLDL2是ef1突變體早期開花的因果基因。此外，利用CRISPR/Cas9技術在HX3背景中敲除GmLDL2基因，生成了兩個Gmldl2突變體Gmldl2-2和Gmldl2-3，它們均表現(xiàn)出早花表型，進一步驗證GmLDL2的功能。這些結果表明GmLDL2在大豆開花調控中起著關鍵作用。
圖2：GmLDL2延遲大豆的開花時間。
a. 在短日照條件下，HX3、ef1和兩個GmLDL2過表達轉基因系的植株和花朵的表型。與ef1相比，兩個GmLDL2互補系開花更晚。b. 在短日照和長日照條件下，HX3、ef1和兩個GmLDL2過表達轉基因系的開花時間。
c. 敲除GmLDL2的CRISPR/Cas9的sgRNA設計。
d. HX3和Gmldl2突變體中GmLDL2的預測氨基酸序列。
e. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3的植株和花朵的表型。與HX3相比，ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3開花更早。
f. 在短日照和長日照條件下，所有受檢品種的開花時間。
g-h. 在短日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2和Gmldl2-3在ZT4時GmFT2a和GmFT5a的表達水平。
（3）GmLDL2的組蛋白去甲基化酶活性測定
通過體外實驗，研究者發(fā)現(xiàn)GmLDL2對H3K4me1和H3K4me2具有去甲基化活性，但對H3K4me3、H3K9me2、H3K27me1或H3K36me3沒有活性。在煙草葉片中瞬時表達GmLDL2，并檢測其對組蛋白修飾的影響，發(fā)現(xiàn)GmLDL2顯著降低了H3K4me1和H3K4me2的信號水平。這些結果表明GmLDL2是一個特異性H3K4去甲基化酶，可能通過調控H3K4me1和H3K4me2水平來作用基因表達。
圖3：GmLDL2是一種H3K4去甲基化酶。
a. 從大腸桿菌中純化的重組His-GmLDL2與小牛胸腺組蛋白一起孵育，用于H3K4me1/2去甲基化活性測定，使用特異性甲基化抗體確定組蛋白的甲基化狀態(tài)。b. 使用ImageJ對（a）進行定量分析。
c. GmLDL2-GFP在本氏煙（N.benthamiana）葉片中顯示出H3K4me1/2去甲基化活性。
d. 對（c）中的熒光信號水平進行統(tǒng)計分析。
（4）GmLDL2介導基因表達的轉錄組分析
對HX3和ef1的葉片進行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)與HX3相比，ef1中有440個基因上調和372個基因下調。GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調基因主要參與激酶活性、轉移酶活性、DNA結合轉錄因子活性和轉錄調控活性，而下調基因主要富集在分子功能、結合、細胞外區(qū)域和細胞壁功能。KEGG分析顯示，上調基因與脂肪酸代謝、亞油酸代謝、單萜生物合成等通路相關，而下調基因主要富集在異喹啉生物堿代謝、檸檬烯和蒎烯降解等通路。這些結果表明GmLDL2可能通過調控這些基因的表達來影響大豆的開花時間和適應性。
圖4：HX3和ef1的轉錄組分析。
a. HX3和ef1中差異表達基因的火山圖。ef1中上調和下調的基因分別用紅色和藍色突出顯示。b-c. 分別在ef1中上調的440個基因或下調的372個基因中富集的GO分析。外圈表示GO分類，中圈表示大豆基因組背景中每個GO基因數(shù)量，內圈表示差異表達基因的數(shù)量。
d. HX3和ef1中已知開花調控基因的表達譜熱圖。
（5）GmLDL2結合位點的ChIP-seq分析
利用ChIP-seq技術，研究者鑒定出GmLDL2在全基因組范圍內的結合位點。通過抗GmLDL2抗體進行ChIP-seq分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2結合位點主要分布在基因區(qū)域，尤其是基因下游區(qū)域。分析H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的分布模式，發(fā)現(xiàn)它們在基因區(qū)域的分布模式不同，H3K4me1和H3K4me2在基因下游區(qū)域的水平較高。這些結果表明GmLDL2可能通過結合特定基因區(qū)域并調控H3K4me1和H3K4me2的水平來影響基因表達。ChIP-seq分析還揭示了GmLDL2結合位點與基因表達水平之間的相關性，為后續(xù)研究提供了重要的線索。
圖5：GmLDL2通過H3K4甲基化調控靶基因GmFER轉錄。
a. 在genebody區(qū)域以及±1.5 kb處的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3信號的歸一化reads分布，線條顯示HX3和ef1中所有基因的平均值。b. 在HX3和ef1中，根據(jù)表達水平分為三組基因的H3K4me1、H3K4me2和H3K4me3的reads分布。將genebody區(qū)域劃分為等分區(qū)間，以10 bp滑動窗口計算TSS上游1.5 kb和TES下游reads分布。Metaplots表示每組基因的歸一化reads分布平均值。熱圖顯示所有基因的reads分布。每組基因按基因表達水平（FPKM）從高到低排序。TSS表示轉錄起始位點，TES表示轉錄終止位點。
c. 在ef1中上調基因、ef1中H3K4me1/2高甲基化基因以及GmLDL2結合基因間的重疊維恩圖。
d. HX3和ef1中GmFER位點的RNA-seq、抗GmLDL2、抗H3K4me1和抗H3K4me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)的基因組軌跡。
e. GmFER表達水平的qRT-PCR分析。
f-g. GmFER位點的H3K4me1和H3K4me2甲基化狀態(tài)的ChIP-qPCR分析。
h. GmLDL2與GmFER位點結合的ChIP-qPCR分析。
（6）鑒定GmLDL2的特定靶基因
結合RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)，研究者鑒定出GmLDL2的特定靶基因GmFER。GmFER基因與擬南芥FERONIA基因同源，其在ef1中的表達顯著上調，并且GmLDL2結合位點的H3K4me1和H3K4me2水平增加。通過RT-qPCR和ChIP-qPCR驗證GmFER在ef1中表達上調，且GmLDL2結合位點的H3K4me1和H3K4me2水平增加。這些結果表明GmLDL2通過直接結合GmFER基因并調控其H3K4me1和H3K4me2水平來抑制其表達，進而調控大豆的開花時間。
（7）GmLDL2通過GmFER依賴性方式負向調控大豆開花
在擬南芥中過表達GmFER，發(fā)現(xiàn)開花時間提前，表明GmFER在開花調控中發(fā)揮促進作用。在大豆中過表達GmFER，同樣發(fā)現(xiàn)開花時間提前。通過CRISPR/Cas9技術在Gmldl2突變體背景下敲除GmFER，生成Gmldl2/fer雙突變體，發(fā)現(xiàn)雙突變體開花時間延遲。這些結果表明GmLDL2通過GmFER依賴性方式負向調控大豆開花，揭示了GmLDL2-GmFER模塊在大豆開花時間調控中的重要作用。
圖6：GmLDL2以GmFER依賴性方式調控開花。
a. 在短日照條件下，HX3和兩個GmFER過表達（GmFER-OE）轉基因系的植株和花朵表型。與HX3相比，兩個獨立的GmFER-OE轉基因植株開花更早。b. HX3和GmFER-OE轉基因植株中GmFER的表達水平。。
c. 使用抗Flag抗體的western blot驗證GmFER-OE轉基因植株中GmFER的表達。
d. 在短日照和長日照條件下，HX3和GmFER-OE植株的開花時間。
e. 在Gmldl2突變體背景下，敲除GmFER的CRISPR/Cas9的sgRNA設計。
f. HX3和Gmldl2/fer雙突變體中GmLDL2和GmFER的預測氨基酸序列。
g. 在長日照條件下，HX3、ef1、Gmldl2-2/fer和Gmldl2-3/fer的植株和花朵表型。與ef1相比，所有Gmldl2/fer雙突變體開花更晚。
h. 在短日照和長日照條件下，所有受檢品種的開花時間。
（8）不同的GmLDL2等位基因促進大豆區(qū)域適應性
通過對2898份大豆品種的全基因組重測序數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)GmLDL2基因存在兩種主要單倍型GmLDL2H1和GmLDL2H2。GmLDL2H1在低緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高，而GmLDL2H2在高緯度地區(qū)的大豆品種中頻率較高。這兩種單倍型的GmLDL2在H3K4me2的去甲基化活性上存在顯著差異，GmLDL2H1的活性高于GmLDL2H2（圖7d-g）。這些結果表明GmLDL2的不同等位基因可能通過調控GmFER表達水平來影響大豆的開花時間和區(qū)域適應性。
圖7：GmLDL2對大豆緯度適應性的貢獻
a. 在野生大豆、地方品種和改良品種中，GmLDL2的2Mb基因組區(qū)域內，F(xiàn)st指示的核苷酸變異情況。b. 在三個種質群體中，GmLDL2單倍型比例。
c. 在中國，攜帶GmLDL2H1和GmLDL2H2栽培品種的地理分布。NE表示中國東北地區(qū)；NR表示中國北部地區(qū)；HR表示中國黃淮地區(qū)；SR表示中國南方地區(qū)。
d. 在本氏煙葉片中對GmLDL2H1和GmLDL2H2的去甲基化活性進行測定。
e. 對(d)中的熒光信號強度進行的統(tǒng)計分析。
f. H3K4me1/2去甲基化活性測定，使用特異性甲基化抗體確定組蛋白的甲基化狀態(tài)。
g. 使用ImageJ對(f)進行的定量分析。
h–j. 在廣州和三亞的自然短日照條件下，攜帶GmLDL2H1（n=18個品種）和GmLDL2H2（n=46個品種）的大豆品種的開花時間、株高和粒重統(tǒng)計情況。
結論和啟示
本研究揭示了GmLDL2在大豆開花進程調控中的重要作用，特別是其通過直接調控GmFER基因表達來影響大豆的開花時間和區(qū)域適應性。GmLDL2作為一個特異性H3K4去甲基化酶，通過結合GmFER基因并調控其H3K4me1和H3K4me2水平來抑制其表達。這一調控機制獨立于經(jīng)典的EC-E1通路，為理解大豆開花進程調控提供了新的視角。此外，GmLDL2的不同等位基因在大豆適應低緯度和高緯度地區(qū)中分別發(fā)揮作用，表明GmLDL2在大豆馴化和適應性進化中具有重要意義。
ChIP-seq和RNA-seq技術在本研究中發(fā)揮了關鍵作用，不僅幫助鑒定GmLDL2的結合位點和靶基因，還揭示了GmLDL2調控基因表達的分子機制。這些技術的應用為未來類似研究提供了寶貴的經(jīng)驗和參考。
參考文獻：
Liu M, Fang Y, Jiang J, Chen H, Yang B, Xu X, Liu G, Ling C, Dong Z, Yang C, Wang Y. Natural variation in histone demethylase GmLDL2 confers flowering time divergence for geographical expansion in soybean. Nat Commun. 2025 Jul 1;16(1):5687. doi: 10.1038/s41467-025-61328-6.
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