植物樣本細(xì)胞核分離試劑盒應(yīng)用：植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)和計(jì)算整合流程

期刊：Plant Methods
影響因子：4.4
通訊單位：華大基因
通訊作者：姜三杰
伯豪技術(shù)產(chǎn)品：伯優(yōu)^®植物樣本細(xì)胞核分離試劑盒

引言
植物單細(xì)胞測(cè)序困局：優(yōu)化抽核方案如何重塑轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的精準(zhǔn)度？
在植物生物學(xué)研究領(lǐng)域，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)正以前所未有的分辨率揭示細(xì)胞異質(zhì)性與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。然而，這項(xiàng)技術(shù)在植物樣本中的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)：細(xì)胞壁的酶解效率、原生質(zhì)體分離過程中的脅迫響應(yīng)、不同組織類型的可及性差異，以及核轉(zhuǎn)錄組與全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組之間的系統(tǒng)性偏差，都讓研究者們?cè)趯?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)解讀上面臨著艱難抉擇。

近日，發(fā)表于《Plant Methods》的一項(xiàng)研究為我們提供了一份詳盡的路線圖。來自多家機(jī)構(gòu)的研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)性地比較了玉米葉片和根尖組織中，基于原生質(zhì)體、新鮮細(xì)胞核及冷凍細(xì)胞核的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)工作流程。值得注意的是，該研究通過使用優(yōu)化的核制備方案——包括采用商品化細(xì)胞核制備試劑盒進(jìn)行改良——成功克服了植物組織中核RNA-seq的多個(gè)技術(shù)瓶頸，為理解植物細(xì)胞異質(zhì)性提供了更全面、更精準(zhǔn)的視角。

主要產(chǎn)品
伯優(yōu)^®植物樣本細(xì)胞核分離試劑盒（技術(shù)產(chǎn)品伯豪生物提供）

主要研究
從“單細(xì)胞”到“單核”：植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)的范式演進(jìn)
植物細(xì)胞因其堅(jiān)韌的細(xì)胞壁和液泡結(jié)構(gòu)，使得完整的原生質(zhì)體制備過程既是一門藝術(shù)，也是一種挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的原生質(zhì)體分離雖然能捕獲較為完整的轉(zhuǎn)錄組信息，但酶解過程不可避免會(huì)誘導(dǎo)應(yīng)激基因的表達(dá)，且難以應(yīng)用于木質(zhì)化程度高或深層組織的研究。相比之下，單核RNA測(cè)序通過直接分離細(xì)胞核，規(guī)避了原生質(zhì)體制備的諸多限制，尤其適用于難以解離的樣本或需要進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組驗(yàn)證的研究場(chǎng)景。

本研究的核心貢獻(xiàn)之一，在于其對(duì)核分離流程的系統(tǒng)性優(yōu)化。研究團(tuán)隊(duì)在核分離緩沖液中添加了RNase抑制劑和DTT，以最大程度保持核內(nèi)RNA的完整性。更重要的是，他們針對(duì)不同組織類型采用了差異化的純化策略：對(duì)于富含次生代謝物和葉綠體的葉片樣本，采用FANS分選獲得高純度細(xì)胞核；而對(duì)于結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的根尖組織，則采用密度梯度離心進(jìn)行富集。這種精細(xì)化的操作不僅保證了核得率，更為后續(xù)高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)奠定了基礎(chǔ)。

數(shù)據(jù)質(zhì)量：核轉(zhuǎn)錄組能否媲美原生質(zhì)體？
對(duì)于習(xí)慣于全細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的研究者而言，核RNA-seq最令人擔(dān)憂的問題莫過于數(shù)據(jù)質(zhì)量的下降。本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)給出了令人信服的答案。

在單細(xì)胞/單核水平上，研究團(tuán)隊(duì)使用了優(yōu)化的DNBelab C4平臺(tái)進(jìn)行文庫構(gòu)建。從表2的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看出，盡管原生質(zhì)體樣本在平均每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因數(shù)（如根原生質(zhì)體達(dá)4,000以上）和UMI計(jì)數(shù)方面仍保持優(yōu)勢(shì)，但冷凍核樣本的表現(xiàn)已相當(dāng)可觀。例如，根冷凍核樣本平均檢測(cè)到的基因數(shù)超過3,000，UMI計(jì)數(shù)超過5,000，這一指標(biāo)顯著優(yōu)于新鮮核樣本，且與以往發(fā)表的植物snRNA-seq研究相比處于較高水平。

這種提升直接歸因于核分離流程的優(yōu)化。在核分離過程中，使用含有高質(zhì)量RNase抑制劑的緩沖液以及溫和的研磨與純化步驟，最大限度地減少了內(nèi)源及外源RNase對(duì)RNA的降解。圖4中基因體覆蓋度曲線清晰地顯示，雖然核樣本相較于原生質(zhì)體存在一定的3‘端偏好性（提示存在部分降解），但冷凍核樣本的覆蓋度曲線明顯優(yōu)于新鮮核樣本，表明液氮速凍結(jié)合優(yōu)化的分離流程能夠更好地維持轉(zhuǎn)錄本完整性。

更重要的是，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一套與單細(xì)胞測(cè)序化學(xué)體系高度匹配的批量RNA-seq流程，為單核數(shù)據(jù)的解讀提供了可靠的參考基準(zhǔn)。表1的批量測(cè)序數(shù)據(jù)表明，核樣本（尤其是冷凍核）的基因組比對(duì)率超過90%，基因比對(duì)率也達(dá)到60%以上。盡管核樣本中不可避免地存在一定比例的rRNA污染（表S2，葉片F(xiàn)ANS純化的核樣本rRNA比例為5.44%-9.09%），但這并不妨礙高質(zhì)量的蛋白編碼基因捕獲。主成分分析（圖4d）顯示，不同制備方法的樣本在相同組織內(nèi)緊密聚集，證明優(yōu)化后的核分離方案能夠很好地保留組織特異的轉(zhuǎn)錄組特征。

圖4. 不同樣本制備類型的bulk RNA-seq文庫評(píng)估

表2. 單細(xì)胞RNA-seq統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)概覽

圖5. 葉片樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型注釋及分布

圖6. 根尖樣本單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型及注釋分布

解讀挑戰(zhàn)與應(yīng)對(duì)策略：如何駕馭核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)？
盡管核數(shù)據(jù)在細(xì)胞類型覆蓋上具有優(yōu)勢(shì)，但其本身也帶來了新的分析挑戰(zhàn)。本研究的系統(tǒng)性評(píng)估為如何應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)提供了實(shí)用指南。

首先是TSO假象問題。由于核樣本中mRNA豐度低、片段較短，反轉(zhuǎn)錄過程中容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。研究團(tuán)隊(duì)展示了使用Cutadapt進(jìn)行TSO序列去除的策略，成功識(shí)別并過濾了含有TSO串聯(lián)體的reads（圖S7），顯著提升了數(shù)據(jù)利用率。

其次是背景噪音問題。由于核分離過程中可能會(huì)吸附環(huán)境中的游離RNA，核數(shù)據(jù)的背景噪音水平通常高于原生質(zhì)體。圖7c顯示，SoupX估算的核樣本污染比例（14%-52%）遠(yuǎn)高于原生質(zhì)體樣本（5%-7%）。為解決這一問題，研究團(tuán)隊(duì)嘗試了CellBender進(jìn)行背景校正。雖然校正后的數(shù)據(jù)（圖S8）成功抑制了某些高豐度基因的污染，但也付出了靈敏度下降的代價(jià)，甚至丟失了原生質(zhì)體中特有的某些細(xì)胞類型標(biāo)記。這一發(fā)現(xiàn)提醒我們：背景校正工具的使用需要權(quán)衡利弊，尤其是在探索性研究中，直接丟棄背景或過度校正可能會(huì)掩蓋真實(shí)的生物學(xué)信號(hào)。研究團(tuán)隊(duì)的建議是，當(dāng)條件允許時(shí)，整合原生質(zhì)體與核數(shù)據(jù)可能是構(gòu)建完整、可靠的植物細(xì)胞圖譜的最優(yōu)策略。

圖7. 不同樣本制備方式轉(zhuǎn)錄組特征的質(zhì)量評(píng)估與比較

轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)：一個(gè)需要高度警惕的技術(shù)偏差
本研究的一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)是，轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜的聚類分析（圖S5）顯示，樣本首先按制備方法（原生質(zhì)體、新鮮核、冷凍核）聚類，而非按組織來源。這一現(xiàn)象揭示了不同分離方法對(duì)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析可能產(chǎn)生系統(tǒng)性影響。盡管研究團(tuán)隊(duì)未能找到顯著富集的特定TF家族，但這仍然是一個(gè)值得高度關(guān)注的警告：在進(jìn)行細(xì)胞身份注釋或調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷時(shí)，方法學(xué)本身引入的偏差可能會(huì)被誤讀為生物學(xué)差異。這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了在研究設(shè)計(jì)中保持方法一致性、以及在進(jìn)行跨數(shù)據(jù)集比較時(shí)充分考慮技術(shù)變量的重要性。

結(jié)論
從玉米出發(fā)，走向更廣闊的植物單細(xì)胞世界
本研究以玉米B73自交系為材料，通過系統(tǒng)性比較原生質(zhì)體、新鮮核與冷凍核的工作流程，為植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)指南。研究數(shù)據(jù)表明，優(yōu)化的核分離方案——特別是基于高質(zhì)量商品化試劑盒的改良流程——能夠在保證數(shù)據(jù)質(zhì)量的同時(shí)，顯著提升對(duì)特定細(xì)胞類型（如維管束鞘細(xì)胞、根冠細(xì)胞）的捕獲能力。

對(duì)于廣大植物科研工作者而言，這項(xiàng)研究傳遞了幾個(gè)關(guān)鍵信息：
原生質(zhì)體仍然是追求最高靈敏度和轉(zhuǎn)錄本覆蓋度的首選，尤其適用于研究葉肉細(xì)胞等易解離的細(xì)胞類型。

當(dāng)研究目標(biāo)涉及難以解離的深層組織、木質(zhì)化細(xì)胞，或需要保留細(xì)胞的空間位置信息時(shí)，冷凍核樣本結(jié)合優(yōu)化的分離與純化流程，是極佳且可靠的替代方案。

在有限條件下，新鮮核也可作為備選，但需嚴(yán)格遵守低溫操作規(guī)范，并預(yù)期其數(shù)據(jù)質(zhì)量（尤其是基因檢出率）會(huì)略有下降。

轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)等分析對(duì)樣本制備方法高度敏感，需要在數(shù)據(jù)解讀時(shí)格外謹(jǐn)慎。

整合原生質(zhì)體與核數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，可能是構(gòu)建最全面、最準(zhǔn)確的植物細(xì)胞圖譜的未來方向。

隨著單細(xì)胞技術(shù)向更多非模式植物物種拓展，本研究提供的優(yōu)化方案和數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估無疑將成為科研人員在選擇實(shí)驗(yàn)策略時(shí)的重要參考。當(dāng)我們面對(duì)植物體內(nèi)那些難以觸及的細(xì)胞類型時(shí)，一管高質(zhì)量分離的細(xì)胞核，或許就是打開新世界大門的那把鑰匙。而這一切的起點(diǎn)，正是一次精心設(shè)計(jì)、嚴(yán)格質(zhì)控的核分離實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：
Wang J, Zheng S, Lu B, et al. Integrated experimental and computational workflows for single-cell transcriptomics in plants. Plant Methods. 2026;22(1):12. Published 2026 Jan 3. doi:10.1186/s13007-025-01490-6

本產(chǎn)品適用于新鮮植物樣本的細(xì)胞核分離。通過裂解細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞核的同時(shí)保持細(xì)胞核膜的穩(wěn)定，經(jīng)密度梯度離心快速地從植物樣本中分離純化細(xì)胞核，并減少碎片及次生代謝產(chǎn)物的殘留。