小鼠模型助力揭示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）介導(dǎo)免疫抑制的新機(jī)制

2026年1月15日，北京大學(xué)張澤民、王東方、席建忠、昌平實(shí)驗(yàn)室李佳楠共同通訊在Cancer Cell（IF=44.5）在線發(fā)表題為“Single-cell screens identify ADAM12 as a fibroblast checkpoint impeding anti-tumor immunity”的研究論文。該研究利用單細(xì)胞篩選鑒定ADAM12為阻礙抗腫瘤免疫的成纖維細(xì)胞關(guān)卡。

南模生物為該研究提供了Pdgfra-CreERT2（NM-KI-225036）及KPC（NM-KI-234804）小鼠模型。

對(duì)癌癥免疫療法難治的患者通常以腫瘤環(huán)境中普遍存在的成纖維細(xì)胞為特征。在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-associated fibroblasts，CAF）中，肌成纖維細(xì)胞通過分泌調(diào)節(jié)因子和重塑胞外基質(zhì)（ECM）來抑制抗腫瘤免疫，使T細(xì)胞被排除在腫瘤核心之外。然而，直接靶向肌成纖維細(xì)胞的策略收效甚微。基于單細(xì)胞測(cè)序已揭示成纖維細(xì)胞的復(fù)雜異質(zhì)性，并暗示其可能存在抗腫瘤功能軸，作者提出一個(gè)策略性思路：并非直接清除肌成纖維細(xì)胞，而是識(shí)別并阻斷阻礙其終末分化、推動(dòng)其從免疫抑制向促免疫狀態(tài)轉(zhuǎn)變的分子檢查點(diǎn)。

1 計(jì)算機(jī)篩選與體外單細(xì)胞篩選揭示肌成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)因子
為系統(tǒng)鑒定成纖維細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究團(tuán)隊(duì)首先整合人類癌癥單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)、GTEx正常組織數(shù)據(jù)和TCGA生存數(shù)據(jù)，設(shè)定成纖維細(xì)胞富集、腫瘤特異性表達(dá)及與不良預(yù)后相關(guān)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬篩選，最終篩選出54個(gè)候選基因（圖1A）。結(jié)果顯示，大多數(shù)候選基因與肌成纖維細(xì)胞特征呈正相關(guān)（圖1B）。綜合三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)候選基因進(jìn)行排序，ADAM12位列榜首，與FAP等已知調(diào)節(jié)因子一同被識(shí)別，證實(shí)了該篩選策略的可靠性（圖1C）。為在患者來源成纖維細(xì)胞中解析肌成纖維細(xì)胞活化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了優(yōu)化的CRISPRi和CRISPRa Perturb-seq系統(tǒng)，構(gòu)建靶向590個(gè)和265個(gè)基因的文庫(kù)，以低感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)直腸癌患者來源成纖維細(xì)胞后獲得超過7萬個(gè)高質(zhì)量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，驗(yàn)證了系統(tǒng)的高效編輯和可靠擾動(dòng)效果（圖1D）。

通過對(duì)未擾動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行非負(fù)矩陣分解，定義了13個(gè)離體轉(zhuǎn)錄模塊，并與包含23,906個(gè)成纖維細(xì)胞的體內(nèi)數(shù)據(jù)集比對(duì)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)保守模塊；進(jìn)一步整合擾動(dòng)數(shù)據(jù)，根據(jù)各模塊擾動(dòng)效應(yīng)的相關(guān)性定義了5個(gè)共調(diào)控程序，包括肌成纖維細(xì)胞樣程序ProgC和干擾素反應(yīng)程序ProgB，且兩者擾動(dòng)效應(yīng)呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)，空間轉(zhuǎn)錄組和MERFISH數(shù)據(jù)證實(shí)其在結(jié)直腸癌組織中呈空間分離分布（圖1E-I；2A-B）。以上結(jié)果通過整合計(jì)算機(jī)篩選與離體功能基因組學(xué)，成功鑒定ADAM12為潛在靶點(diǎn)，并揭示干擾素反應(yīng)程序ProgB是肌成纖維細(xì)胞程序ProgC的主要拮抗軸。

圖1. 計(jì)算機(jī)模擬與離體篩選揭示肌成纖維細(xì)胞程序調(diào)控因子

2 增強(qiáng)ProgB和降低ProgC誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞內(nèi)在的抗腫瘤活性
為驗(yàn)證ProgB和ProgC的功能效應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)首先用TGF-β或IFN-β處理患者來源成纖維細(xì)胞，隨后進(jìn)行批量RNA-seq以評(píng)估表型變化，結(jié)果顯示TGF-β處理增強(qiáng)ProgC并抑制ProgB，IFN-β處理則相反，證實(shí)了ProgC和ProgB之間的拮抗關(guān)系（圖2C-D）。隨后采用患者來源成纖維細(xì)胞（PDF）-腫瘤樣細(xì)胞簇（PTC）共培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)，ProgC ^high成纖維細(xì)胞促進(jìn)了PTC的擴(kuò)張生長(zhǎng)，而ProgB ^high成纖維細(xì)胞則抑制其生長(zhǎng)（圖2E-G）。為在體內(nèi)TME中驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)將經(jīng)TGF-β或IFN-β預(yù)處理的成纖維細(xì)胞與MC38腫瘤細(xì)胞共注射至小鼠體內(nèi)（該模型以高成纖維細(xì)胞含量為特征），結(jié)果顯示ProgC ^high成纖維細(xì)胞腫瘤負(fù)荷增加，而ProgB ^high組則減緩了腫瘤進(jìn)展（圖2H-J）。以上結(jié)果表明，與促腫瘤的ProgC高狀態(tài)相反，IFN-β誘導(dǎo)的ProgB高狀態(tài)賦予成纖維細(xì)胞內(nèi)在的抗腫瘤活性。

圖2. 增強(qiáng)ProgB與降低ProgC可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞內(nèi)在抗腫瘤活性

3 單細(xì)胞篩選聚焦于ADAM12
為篩選出能同時(shí)增強(qiáng)ProgB并抑制ProgC的調(diào)節(jié)因子，研究團(tuán)隊(duì)整合CRISPR篩選與計(jì)算機(jī)模擬分析，發(fā)現(xiàn)ADAM12在離體擾動(dòng)中同時(shí)滿足上述效應(yīng)，且在體內(nèi)與ProgB呈負(fù)相關(guān)、與ProgC呈正相關(guān)，在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中特異性高表達(dá)，因此被確定為優(yōu)先靶點(diǎn)（圖2K-L；3A-C）。鑒于ADAM12存在兩種異構(gòu)體，研究團(tuán)隊(duì)通過轉(zhuǎn)錄本定位和異構(gòu)體特異性qPCR證實(shí)，長(zhǎng)亞型ADAM12L是癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中的主要表達(dá)形式（圖3D-G）。

為驗(yàn)證ADAM12的功能，研究團(tuán)隊(duì)在患者來源成纖維細(xì)胞中分別進(jìn)行ADAM12敲除和過表達(dá)，結(jié)果顯示敲除ADAM12后，ProgC相關(guān)基因（如COL1A1、TAGLN和COL12A1）的表達(dá)下調(diào)、ProgB相關(guān)基因（如IFIT1、IFIT2和IFIT3）表達(dá)上調(diào)，而過表達(dá)則呈現(xiàn)相反效應(yīng)（圖3H-K）。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，ADAM12敲除抑制TGF-β信號(hào)并增強(qiáng)了IFN-I信號(hào)和IFN反應(yīng)性，而過表達(dá)則呈現(xiàn)相反效應(yīng)（圖3L）。以上結(jié)果表明，ADAM12通過增強(qiáng)TGF-β信號(hào)并抑制IFN-I信號(hào)，作為分子開關(guān)調(diào)控肌成纖維細(xì)胞樣表型與干擾素反應(yīng)表型之間的平衡。

圖3. 單細(xì)胞篩選技術(shù)聚焦于ADAM12

4 ADAM12重塑TGF-β和IFN-I信號(hào)之間的串?dāng)_
為探究ADAM12是否能直接調(diào)控TGF-β和IFN-I信號(hào)，研究團(tuán)隊(duì)建立了由pSMAD2/3結(jié)合元件控制的TGF-β反應(yīng)性熒光素酶報(bào)告基因，在成纖維細(xì)胞中證實(shí)TGF-β刺激可上調(diào)ADAM12表達(dá)。隨后構(gòu)建ADAM12敲除和過表達(dá)細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)ADAM12敲除后TGF-β信號(hào)減弱，而過表達(dá)則顯著增強(qiáng)該信號(hào)（圖3L），且在IFN-β刺激下，ADAM12過表達(dá)細(xì)胞中STAT1磷酸化水平及干擾素刺激基因表達(dá)均顯著降低。

TGF-β和IFN信號(hào)以復(fù)雜的方式相互作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證ADAM12對(duì)信號(hào)串?dāng)_的調(diào)控作用，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了三種的處理：順序TGF-β→IFN-β或IFN-β→TGF-β刺激，以及同時(shí)刺激，隨后監(jiān)測(cè)熒光素酶活性（圖3M）。結(jié)果顯示，ADAM12過表達(dá)在所有處理情況下均增強(qiáng)TGF-β信號(hào)并抵抗IFN-β的抑制作用，而ADAM12敲除則持續(xù)減弱TGF-β信號(hào)（圖3M）。以上結(jié)果表明，ADAM12具有雙重作用：增強(qiáng)TGF-β信號(hào)并抑制IFN-I信號(hào)。

5 ADAM12缺失限制腫瘤進(jìn)展
為探究ADAM12缺失對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，研究團(tuán)隊(duì)首先利用PDF-PTC共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)ADAM12敲除成纖維細(xì)胞抑制PTC生長(zhǎng)，而過表達(dá)則促進(jìn)PTC生長(zhǎng)（圖4A-B）。為進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)將sgRosa26或sgAdam12成纖維細(xì)胞與MC38腫瘤細(xì)胞共注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)sgAdam12組腫瘤生長(zhǎng)顯著減緩（圖4C-D）。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析顯示，sgRosa26組來源的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出GM6和GM7的高表達(dá)，而sgAdam12組的成纖維細(xì)胞則表現(xiàn)出更高水平的GM4和GM5（圖4E）。差異表達(dá)分析證實(shí)sgAdam12組中TGF-β反應(yīng)性基因下調(diào)、干擾素反應(yīng)基因上調(diào)（圖4F）。亞群分析進(jìn)一步揭示，sgAdam12組中終末分化的肌成纖維細(xì)胞簇比例減少，而早期祖細(xì)胞樣狀態(tài)簇比例增加（圖4G-I）。以上結(jié)果表明，ADAM12缺失通過將成纖維細(xì)胞從促腫瘤的肌成纖維細(xì)胞狀態(tài)重塑為祖細(xì)胞樣狀態(tài)，從而限制腫瘤進(jìn)展。

圖4. 靶向ADAM12重塑三維腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞

6 成纖維細(xì)胞特異性ADAM12缺失降低多種模型中的腫瘤負(fù)荷
為在體內(nèi)驗(yàn)證ADAM12的促腫瘤功能，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了Pdgfra^CreERT2; Adam12^flox/flox（Adam12-pCKO）小鼠模型，該小鼠可在他莫昔芬誘導(dǎo)后實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞特異性ADAM12缺失（圖5A），并在皮下分別接種B16黑色素瘤、MC38結(jié)直腸癌或KPC胰腺癌細(xì)胞系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在三種皮下腫瘤模型中，pCKO小鼠均表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制和腫瘤重量降低（圖5D-F）。進(jìn)一步在原位Lewis肺癌和B16肺轉(zhuǎn)移模型中，pCKO小鼠同樣顯示腫瘤進(jìn)展受抑（圖5G-H）。對(duì)三個(gè)皮下模型的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，pCKO成纖維細(xì)胞在所有模型中均表現(xiàn)為ProgC特征降低、ProgB特征升高（圖5I）。整合聚類分析揭示pCKO組中高表達(dá)ProgC的終末分化肌成纖維細(xì)胞簇比例減少，而富集ProgB的祖細(xì)胞樣簇比例增加（圖5J）。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，pCKO組中TGF-β信號(hào)、膠原組織和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因下調(diào)，而抗原呈遞和干擾素反應(yīng)基因上調(diào)（圖5K）。以上結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞特異性ADAM12缺失在多種腫瘤模型中通過重塑成纖維細(xì)胞表型并影響癌細(xì)胞狀態(tài)，持續(xù)減少腫瘤負(fù)擔(dān)。

圖5. 靶向ADAM12可降低多種臨床前模型中的腫瘤負(fù)荷

7 ADAM12缺失重塑TME并增強(qiáng)CD8⁺ T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)
為探究ADAM12缺失如何重塑腫瘤微環(huán)境，研究團(tuán)隊(duì)首先分析了B16肺轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果顯示，pCKO小鼠中CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)增加、血管結(jié)構(gòu)破壞減少（圖6A-C）。對(duì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行批量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，pCKO組中ECM沉積相關(guān)基因協(xié)同下調(diào)，免疫反應(yīng)通路富集，且成纖維細(xì)胞中Cd40、內(nèi)皮細(xì)胞中Cd74和MHC-II分子表達(dá)上調(diào)（圖6D-I）。隨后對(duì)KPC模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)增加（圖6J）。單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果顯示pCKO組中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少，而γδ T細(xì)胞和CD8⁺ T細(xì)胞比例增加（圖6K）。進(jìn)一步分析顯示，pCKO來源的CD8⁺ T細(xì)胞高表達(dá)效應(yīng)分子Gzmh和Ifng，同時(shí)伴隨耗竭標(biāo)志物Pdcd1上調(diào)（圖6L-M）。細(xì)胞通訊分析顯示，pCKO組中CD8⁺ T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的IFNG-IFNGR1/2軸增強(qiáng)，且富集與細(xì)胞毒性T細(xì)胞定位相關(guān)的CXCL16-CXCR6相互作用（圖6N-O）。以上結(jié)果表明，ADAM12缺失通過重塑基質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)、增強(qiáng)CD8⁺ T細(xì)胞效應(yīng)功能，重塑腫瘤微環(huán)境并促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖6. ADAM12基因敲除可降低腫瘤負(fù)荷并促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)

8 ADAM12基因缺失增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)
為探究ADAM12缺失是否增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷療效，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)pCKO小鼠模型和對(duì)照小鼠均皮下接種KPC胰腺癌細(xì)胞系，并給與抗PD-L1治療（圖7A）。結(jié)果顯示，pCKO組抗PD-L1治療顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（圖7B）。為評(píng)估ADAM12在人類癌癥中的臨床相關(guān)性，研究團(tuán)隊(duì)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，ADAM12高表達(dá)與多種癌癥類型的不良預(yù)后相關(guān)，且與CD8⁺ T細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)（圖7C-D）。進(jìn)一步分析結(jié)直腸癌和乳腺癌免疫治療隊(duì)列的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，與非應(yīng)答者相比，應(yīng)答者腫瘤成纖維細(xì)胞中ADAM12表達(dá)更低、ProgB/ProgC比值更高、TGF-β信號(hào)更弱而IFN-I反應(yīng)更強(qiáng)（圖7E）。在結(jié)直腸癌患者中，治療后腫瘤消退率與ADAM12表達(dá)下調(diào)程度呈正相關(guān)，且ADAM12表達(dá)動(dòng)態(tài)與腫瘤反應(yīng)性CD8⁺ T細(xì)胞變化呈負(fù)相關(guān)（圖7E）。以上結(jié)果表明，ADAM12缺失可增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)阻斷療效，且ADAM12在人類癌癥中與免疫治療應(yīng)答密切相關(guān)，提示其作為治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。

圖7. ADAM12基因敲除增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICB）應(yīng)答

總之，該研究成功構(gòu)建了“計(jì)算預(yù)測(cè)→功能篩選→機(jī)制解析→療效驗(yàn)證”的完整研究路徑，系統(tǒng)揭示了CAFs中可被干預(yù)的“抗腫瘤軸線”，并識(shí)別出ADAM12為調(diào)控該過程的關(guān)鍵靶點(diǎn)。與具有廣泛毒副作用的TGFβ通路抑制方案相比，ADAM12在正常組織中表達(dá)極低，具備更高的治療特異性與安全性。該研究為克服免疫治療耐藥，尤其是改善‘冷腫瘤’微環(huán)境，提供了新的潛在策略與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖8. 研究模式圖

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