昆蟲細(xì)胞（SF9）自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力測(cè)定的不同染色方法比較

1、 引言
蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞）在生命科學(xué)、生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)中廣泛應(yīng)用。值得注意的是，SF9 細(xì)胞系等昆蟲細(xì)胞因其以下優(yōu)勢(shì)被廣泛用于蛋白質(zhì)表達(dá)：培養(yǎng)簡(jiǎn)便、放大工藝成本效益高，且與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比對(duì)滲透壓的耐受性更強(qiáng)。然而，確保高質(zhì)量的蛋白質(zhì)生產(chǎn)需要監(jiān)測(cè)細(xì)胞濃度和活性，以維持健康的細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定的蛋白質(zhì)產(chǎn)出。當(dāng)與合適的染色方法配合使用時(shí)，點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可以為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供一種便捷的技術(shù)。本研究旨在通過比較不同的活力染色劑，推薦用于評(píng)估 SF9 細(xì)胞活力的最佳染料。

2、 染色方案
分別用 0.4% 的臺(tái)盼藍(lán)染色液（T13001）、吖啶橙（AO）/ 碘化丙啶（PI）染色液（F23001）以及熒光素二乙酸酯（FDA）/ 碘化丙啶（PI）染色液（F23214）對(duì) SF9 細(xì)胞進(jìn)行染色。

2.1 臺(tái)盼藍(lán)染色
1.混合：

• 10 微升 0.4% 的臺(tái)盼藍(lán)（TB）
• 10 微升細(xì)胞樣本

2.將10 微升染色后樣本加入載玻片

3.使用點(diǎn)成LUNA-FX7™進(jìn)行分析
* 默認(rèn)方案

2.2 熒光染色
1.混合：

• 2 微升預(yù)混染料，或者每種染料各 1 微升
• 18 微升細(xì)胞樣本

2.將 10 微升染色后樣本加入載玻片
3.使用點(diǎn)成LUNA-FX7™進(jìn)行分析
* 注意：根據(jù)所使用的染料，SF9 細(xì)胞可能會(huì)表現(xiàn)出不同的熒光強(qiáng)度。請(qǐng)根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整
 
3、 用于活性測(cè)定的染料
我們選擇了四種常用的用于活性評(píng)估的染料：
4、 評(píng)估 SF9 細(xì)胞的最佳染料
總結(jié)：臺(tái)盼藍(lán)和FDA/PI都適用于SF9 細(xì)胞活性評(píng)估（圖 1 A），但 FDA/PI 是更優(yōu)的選擇。
       
臺(tái)盼藍(lán)常用于評(píng)估 SF9 細(xì)胞的濃度和活性。然而，我們建議貼壁培養(yǎng)時(shí)避免使用臺(tái)盼藍(lán)，因其在傳代過程中需要物理吹打操作。SF9 細(xì)胞對(duì)機(jī)械力和攪拌敏感，貼壁培養(yǎng)時(shí)易產(chǎn)生細(xì)胞碎片，導(dǎo)致臺(tái)盼藍(lán)與樣本中各類顆粒發(fā)生非特異性結(jié)合（懸浮培養(yǎng)中此問題較不明顯）。
       
在熒光染料組合評(píng)估中，采用 AO/PI 染色的 U937 細(xì)胞作為參照驗(yàn)證染料性能。盡管 AO/PI 染色對(duì)多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有效，但其效果因細(xì)胞類型而異。實(shí)驗(yàn)顯示，AO/PI 染色的 SF9 細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度較低，推測(cè)可能與昆蟲細(xì)胞基因組尺寸顯著小于哺乳動(dòng)物細(xì)胞有關(guān)。通過將綠光（GF）和紅光（RF）曝光水平從哺乳動(dòng)物細(xì)胞常規(guī)的 5 級(jí)調(diào)整至 7 級(jí)，雖 PI 信號(hào)充足，但 AO 信號(hào)強(qiáng)度仍弱。盡管所有細(xì)胞均被成功標(biāo)記，AO 的弱信號(hào)仍可能影響整體檢測(cè)性能（圖 1B）。
       
綜合上述問題，在測(cè)試的染料組合中，F(xiàn)DA/PI 是 SF9 細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性評(píng)估的最佳選擇。FDA 依賴細(xì)胞酯酶活性（該特性對(duì)酵母、昆蟲細(xì)胞等不同類型細(xì)胞均有效，不受基因組大小影響），可在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生高強(qiáng)度信號(hào)，僅需將 GF 曝光水平降至 1 級(jí)。通過優(yōu)化 LED 參數(shù)（GF 1 / RF 7），F(xiàn)DA/PI 染料組合成為 SF9 細(xì)胞評(píng)估的首選方案。 圖 1. （A）使用TB、AO/PI和FDA/PI對(duì) SF9 細(xì)胞的染色結(jié)果。TB和 FDA/PI 能有效地對(duì) SF9 細(xì)胞進(jìn)行染色，而 AO/PI 顯示出較低的綠色信號(hào)。
（B）用 AO/PI 和 FDA/PI 染色的 SF9 細(xì)胞與用 AO/PI 染色的 U937 細(xì)胞的染色結(jié)果比較。對(duì)每個(gè)樣本采用了不同的曝光 水平。
標(biāo)注：所有通道（熒光通道和明場(chǎng)通道）的合成圖像，已識(shí)別的物體用紅色和綠色圓圈標(biāo)記。紅色圓圈表示死細(xì)胞，綠色圓圈表示活細(xì)胞。

5、 結(jié)論
鑒于 FDA/PI組合的穩(wěn)定性能和廣泛適用性，其為 SF9 細(xì)胞活性評(píng)估的最佳選擇。使用該組合時(shí)需將點(diǎn)成LUNA-FX7™的 LED 曝光參數(shù)調(diào)整為 GF 1（綠光 1 級(jí)）/ RF 7（紅光 7 級(jí)）—— 這是由于 FDA 在昆蟲細(xì)胞中可產(chǎn)生高強(qiáng)度信號(hào)，而 PI 信號(hào)相比哺乳動(dòng)物細(xì)胞可能較弱。
       
對(duì)于貼壁培養(yǎng)的 SF9 細(xì)胞，不建議使用臺(tái)盼藍(lán)染色（懸浮培養(yǎng)時(shí)該問題可部分緩解）。此外，雖可通過提高 LED 曝光水平改善 AO/PI 染色后 AO的弱信號(hào)問題，但可能影響點(diǎn)成LUNA-FX7™自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的整體檢測(cè)性能。
       
綜上，選擇合適的染料（如 FDA/PI）并優(yōu)化點(diǎn)成LUNA-FX7™的曝光參數(shù)，可為 SF9 細(xì)胞質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供理想解決方案。