破壁靈芝孢子粉三萜含量紫外分光光度法測定的比較研究

摘要：
目的 本研究旨在探討不同標準紫外分光光度法測定破壁靈芝孢子粉三萜含量的應(yīng)用。方法 通過采用《中華人您共和國藥典》、團體標準、保健食品標準與企業(yè)內(nèi)部標準的紫外分光光度法，對破壁靈芝孢子粉三萜進行定量分析。結(jié)果4種研究方法中，三萜含量結(jié)果從高到低分別是企業(yè)標準17.9%、團體標準13.0%、《中華人您共和國藥典》12.9%、保健食品標準5.7%。結(jié)論說明在實際應(yīng)用中需要根據(jù)具體情況選擇合適的標準，或建立更為準確和標準化的測定方法，以確保破壁靈芝孢子粉中三萜含量測定的準確性和一致性。

引言
靈芝孢子是靈芝的繁殖器官，含有豐富的多糖、三萜、甾體等活性成分。由于靈芝孢子具有堅硬的幾丁質(zhì)外殼,導致其內(nèi)部活性成分難以被人體腸道吸收消化。研究顯示,未破壁靈芝孢子粉人體吸收率僅為12%,而破壁后可達95%。因此,通過破壁處理將靈芝孢子轉(zhuǎn)化為破壁靈芝孢子粉,能有效釋放內(nèi)部活性成分,提升其營養(yǎng)價值。三萜是靈芝的重要活性成分,具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、保肝及降血糖等多種藥理作用,其含量是評價靈芝藥用價值的重要指標。目前,三萜的測定方法尚未統(tǒng)一,主要依據(jù)《中華人民共和國藥典》(下述簡稱《中國藥典》)、團體標準T/FJHX0001—2022及保健食品相關(guān)標準,其均采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法(以齊墩果酸或熊果酸為對照品),但測定結(jié)果存在較大差異。本研究通過對比不同標準及企業(yè)內(nèi)部標準,從標準溶液配制、提取條件和反應(yīng)參數(shù)等方面分析破壁靈芝孢子粉三萜含量測定的影響因素,旨在為建立更科學的質(zhì)量標準及真?zhèn)舞b別提供參考依據(jù)。

1.材料與方法
1.1實驗試劑
原料:破壁靈芝孢子粉
甲醇、乙醇、冰乙酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、高氯酸；香草醛；齊墩果酸標準品；熊果酸標準品
1.2儀器與設(shè)備
UV-1700紫外可見分光光度計；分析天平；可調(diào)氮吹儀；離心機；振蕩器；超聲波水浴鍋；水浴鍋。
1.3試驗方法
1.3.1《中國藥典》標準
稱取齊墩果酸對照品適量,甲醇配成0.2mg/mL溶液。梯度取樣于帶蓋試管,揮干放冷后,加新制香草醛-冰醋酸液0.2mL、高氯酸0.8mL,搖勻,70℃水浴加熱15min,冰浴冷卻5min,再加乙酸乙酯4mL搖勻,以試劑空白為參比,在546nm波長測定吸光度,繪制標準曲線。稱取破壁靈芝孢子粉樣品0.15g,加乙醇50mL超聲45min,濾過,濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶,加乙醇定容至100mL,按《中國藥典》方法測吸光度,從標準曲線讀取齊墩果酸含量并計算三萜含量。
1.3.2團體標準
稱取齊墩果酸對照品,用乙酸乙酯溶解并超聲15min,制成0.1mg/mL溶液。梯度取樣于試管,100℃水浴蒸干后,加0.2mL香草醛-冰醋酸液及0.8mL高氯酸,70℃水浴加熱15min,冰浴冷卻5min,再加4mL 乙酸乙酯搖勻,于546nm波長測定吸光度,繪制標準曲線。稱取破壁靈芝孢子粉0.15g,置100mL容量瓶,加80mL無水乙醇超聲30min,定容過濾得供試液。按團體標準法測吸光度,通過標準曲線計算三萜含量。
1.3.3保健食品標準
稱取熊果酸對照品,加入乙酸乙酯溶解,按保健食品標準配制成標準溶液;同步制備破壁靈芝孢子粉供試液。梯度量取標準品于試管,60℃水浴蒸干后,加0.4mL5%香草醛-冰
乙酸溶液溶解殘渣,再加1.0mL高氯酸混勻,60℃水浴加熱15min,冰浴冷卻后加5.0mL冰乙酸顯色,于548nm波長測定吸光度繪制標準曲線。量取試樣上清液1.0mL同法處理,根據(jù)標準曲線計算三萜濃度。
1.3.4企業(yè)內(nèi)部標準
稱取齊墩果酸對照品,稱定后用甲醇溶解,梯度取樣于帶蓋試管,揮干放冷,加入新配香草醛-冰醋酸液0.2mL及高氯酸0.8mL,70℃水浴加熱30min,冰浴冷卻5min,加乙酸乙酯4mL搖勻,以試劑空白為參比,在546nm 波長測定吸光度繪制標準曲線。稱取破壁靈芝孢子粉 0.15g,加乙醇50mL,超聲提取并濾過,濾液定容至100mL,按企業(yè)標準法測吸光度,通過標準曲線計算三萜含量。
1.3.5方法學驗證
對比4種不同三萜測定方法的差異,考察標準溶液(對照品選擇)、提取條件(溶劑類型、提取時間)及反應(yīng)參數(shù)(顯色溫度、時間)等關(guān)鍵因素對測定結(jié)果的影響。

2.結(jié)果與分析
2.1不同測定方法三萜結(jié)果比較
采用《中國藥典》、團體標準、保健食品及企業(yè)內(nèi)部標準4種方法測定三萜含量,結(jié)果依次為12.9%、13.0%、5.7%和17.9%。其中,企業(yè)內(nèi)部標準測定值最高,保健食品標準測定值最低。各方法顯色反應(yīng)條件如下:《中國藥典》與團體標準均為70℃水浴15min;保健食品標準為60℃水浴15min;企業(yè)內(nèi)部標準為70℃水浴30min。結(jié)果表明,在反應(yīng)時間相同時,反應(yīng)溫度越高,三萜測定結(jié)果越高;在反應(yīng)溫度相同時,反應(yīng)時間越長,三萜測定結(jié)果也越高。
2.2三萜不同測定方法的差異分析
4種方法均基于紫外分光光度法,通過化學顯色反應(yīng)原理,利用特定波長下的吸光度定量分析靈芝三萜含量。但各標準的操作細節(jié)存在差異(表1),主要體現(xiàn)為標準物質(zhì)不同、溶劑揮發(fā)方式不同、顯色反應(yīng)的溫度與時間不同。

2.3不同過濾方法對結(jié)果的影響
2.3.1濾紙與離心處理對結(jié)果的影響
采用1.3.3保健食品標準方法,分別對樣品提取液進行濾膜(孔徑0.22μm)過濾和6000r/min,離心10min處理。濾膜過濾后的提取液澄清透明,與標準溶液一致,三萜測定值為3.57%;離心處理后的上清液顏色渾濁,干擾顯色反應(yīng),三萜測定值為5.70%。
2.3.2不同濾紙過濾對結(jié)果的影響
采用1.3.4企業(yè)內(nèi)部標準方法,分別用GF/A濾紙、雙圈定量濾紙、雙圈定性濾紙過濾提取液。結(jié)果顯示:GF/A濾紙濾液澄清透明,另兩種濾紙濾液呈淺褐色(靜置過夜后出現(xiàn)沉淀)。3種濾液的三萜測定值分別為17.9%、17.8%、18.9%,差異較小,但濾液顯色后與標準品色系不一致,推測濾紙過濾處理后的提取液可能存在非三萜物質(zhì),導致測定值偏高。
2.4同一測定方法不同標準物質(zhì)的結(jié)果分析
采用1.3.3保健食品標準方法,分別以熊果酸和齊墩果酸作為標準品繪制標準曲線進行測定。結(jié)果顯示(表2),10組數(shù)據(jù)的三萜平均值為3.8%,相對標準偏差為4.90%,單因素方差分析 P<0.5,表明兩種標準品對三萜測定結(jié)果無顯著影響。

2.5保健食品標準與企業(yè)內(nèi)部標準組合試驗分析
選取標準物質(zhì)、溶劑揮發(fā)方式、顯色條件均不同的保健食品標準與企業(yè)內(nèi)部標準進行組合試驗(表3)。結(jié)果顯示,當標準溶液和樣品提取步驟一致時,顯色條件差異(70℃水浴30minvs.60℃水浴15min)導致三萜結(jié)果差異顯著(方案一15.3%vs.方案二5.1%,差值10.2%;方案三16.0%vs.方案四4.0%,差值12%)。當顯色條件和標準品一致時,樣品提取方式對三萜結(jié)果影響較小(方案一與方案三差值0.7%,方案二與方案四差值1.1%)。說明顯色反應(yīng)溫度及時間與三萜結(jié)果呈正相關(guān)。


3.討論與結(jié)論
本研究采用4種紫外分光光度法測定破壁靈芝孢子粉的三萜含量,結(jié)果顯示不同方法的測定結(jié)果存在較大差異,其含量由高至低依次為企業(yè)內(nèi)部標準 (17.9%)、團體標準(13.0%)、《中國藥典》(12.9%)、保健食品(5.7%)。在實際應(yīng)用中,建議根據(jù)研究目的和實際條件選擇合適的測定方法,并在必要時結(jié)合高效液相色譜法或液質(zhì)聯(lián)用法等其他技術(shù)手段進行結(jié)果驗證,以消除測定結(jié)果的差異。
文章來源：宋利軍,等:破壁靈芝孢子粉三萜含量紫外分光光度法測定的比較研究