Pipetty 電動移液器在副豬格拉瑟菌檢測中的應用

方案摘要：本方案旨在界定Pipetty電動移液器在豬格拉瑟病（副豬格拉瑟菌）巢式PCR檢測中的具體應用流程，通過標準化實驗操作，結(jié)合該移液器精準、高效的液體處理優(yōu)勢，實現(xiàn)對副豬格拉瑟菌的快速、準確檢測。方案涵蓋實驗原理、實驗準備、操作步驟及結(jié)果判定等核心環(huán)節(jié)，為畜牧獸醫(yī)領域開展豬格拉瑟病檢測工作提供標準化技術(shù)參考，保障檢測結(jié)果的可靠性與重復性，助力疫病的早發(fā)現(xiàn)、早防控。
 
方案詳情：
一、實驗原理
副豬格拉瑟菌為革蘭氏陰性菌，是豬格拉瑟病的致病菌，本實驗采用巢式PCR技術(shù)，以副豬格拉瑟菌DNA為檢測靶標，通過兩輪特異性擴增對靶標基因進行富集與擴增。Pipetty電動移液器精準移取各反應試劑，構(gòu)建標準化PCR反應體系，經(jīng)擴增儀完成循環(huán)擴增后，通過電泳檢測擴增產(chǎn)物，依據(jù)特異性條帶的出現(xiàn)情況判定樣品中是否含有副豬格拉瑟菌。巢式PCR技術(shù)憑借兩輪擴增的特異性篩選，可顯著提高檢測的靈敏度與特異性，結(jié)合Pipetty電動移液器的高精度移液能力，有效降低實驗誤差，提升檢測準確性。
 
二、‌實驗準備
1、儀器設配
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自動化核酸提取儀；
③ PCR擴增儀；
④ 臺式低溫高速離心機(最大離心力12000g以上)；
⑤ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像儀(或紫外透射儀)。
 
2、試劑和材料
① 陽性對照：滅活的副豬格拉瑟菌標準菌株；
② 陰性對照：滅菌的TSB培養(yǎng)基；
③ 上、下游引物;
④ 核酸提取試劑盒。
三、實驗步驟
1、采用核酸提取試劑盒或自動化核酸提取儀提取豬臨床樣品中的副豬格拉瑟菌DNA。提取過程中，使用Pipetty電動移液器，精準移取提取試劑及樣品，嚴格按照試劑盒說明書操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h內(nèi)進行檢測，可將DNA置于冰上臨時保存；若需長時間存放，應置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
2、使用Pipetty電動移液器精準移取各試劑，構(gòu)建總體積為25μL的反應體系，具體試劑用量如下：
10×PCR緩沖液（含Mg²⁺）      2.5μL
dNTPs（2.5 mmol/L）            2μL
引物P1                         0.5μL
引物P2                         0.5μL
ExTag DNA聚合酶（5U/μL）      0.25μL
滅菌雙蒸水                     17.25μL
上述試劑總體積為23μL，室溫融化后，使用Pipetty電動移液器，設置連續(xù)分液模式，將上述試劑移取至PCR反應管中，每移取一種試劑后更換槍頭，避免交叉污染。試劑加完后，將反應管置于臺式低溫高速離心機中瞬時離心，使液體全部聚集在管底部。隨后，用Pipetty電動移液器移取2μL制備好的樣品核酸，加入反應管中，混勻模式，充分混勻后再次瞬時離心，確保液體完全聚集于管底，避免局部試劑濃度不均影響擴增效果。
 
3、將配制好的反應管放入PCR擴增儀中，設置如下程序：95℃預變性5min，徹底打開DNA雙鏈；隨后進入循環(huán)階段，94℃變性45s（使DNA雙鏈解旋）、58℃退火45s（使引物與靶基因特異性結(jié)合）、72℃延伸45s（DNA聚合酶催化鏈延伸），共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，確保擴增產(chǎn)物完全延伸。反應結(jié)束后，取出反應管，置于2℃~8℃條件下保存，備用。
4、采用與第一輪相同的體積配比，構(gòu)建總體積23μL的反應體系Ⅱ，室溫融化后，使用Pipetty電動移液器精準移取各試劑，更換槍頭防污染，室溫融化后瞬時離心，再加入2μL第一輪PCR擴增產(chǎn)物作為模板，混勻后瞬時離心，確保反應體系均一。
 
5、擴增條件與上一輪一致，反應結(jié)束后，置于2℃~8℃保存，待電泳檢測。
6、稱取1.2g瓊脂糖加入100mL核酸電泳緩沖液中加熱至沸騰，充分溶化后放涼至50℃左右，加入核酸染色劑10μL，混勻，倒入膠槽制備凝膠板。在電泳槽中加入1×TAE核酸電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。分別取樣品PCR擴增產(chǎn)物、陰/陽性對照擴增產(chǎn)物10μL和2μL 6×電泳上樣緩沖液混合后，分別加樣到各凝膠孔中，取5μL DNA分子質(zhì)量標準加入一凝膠孔中。5V/cm恒壓下電泳30min左右，將電泳好的凝膠置紫外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，進行判定并做好試驗記錄。
四、結(jié)果判定
1、試驗結(jié)果成立條件
副豬格拉瑟菌陽性對照的巢式PCR擴增產(chǎn)物電泳后在312bp位置出現(xiàn)特異性條帶，同時陰性對照的PCR擴增產(chǎn)物電泳后沒有任何條帶，則試驗結(jié)果成立；否則結(jié)果不成立。
2、陽性判定
在試驗結(jié)果成立的前提下，如果樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在312bp位置上出現(xiàn)特異性條帶，判定為副豬格拉瑟菌通用型核酸檢測陽性。
3、陰性判定
在試驗結(jié)果成立的前提下，如果樣品在312bp位置未出現(xiàn)特異性條帶，判定為副豬格拉瑟菌通用型核酸檢測陰性。