牛羊副流感熒光RT-PCR檢測的原理與實驗流程

方案摘要：本方案旨在建立基于Pipetty電動移液器的牛羊副流感（BPIV3/CPIV3病毒核酸精準檢測流程。通過Pipetty電動移液器的高精度移液與連續(xù)分液功能，實現(xiàn)樣本核酸提取、RT-PCR反應體系配制、產(chǎn)物移取等全流程標準化操作，規(guī)避手動移液誤差。流程核心為：樣本預處理后提取病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，精準配制PCR反應體系并設置陰陽性對照，上機擴增后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。該方案借助Pipetty電動移液器的溫度補償、輕便操作等優(yōu)勢，提升檢測效率與結(jié)果可靠性，適配養(yǎng)殖場、檢測機構(gòu)等批量牛羊樣本的副流感病毒快速篩查。
 
方案詳情：

• 實驗原理

牛羊副流感病毒（BPIV3、CPIV3）為單股負鏈RNA病毒，本實驗基于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應技術(shù)，利用特異性引物對病毒RNA進行靶向檢測。首先通過病毒RNA提取試劑盒裂解樣本、釋放病毒RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）；隨后以cDNA為模板，在PCR預混液提供的酶、dNTPs等條件下，通過引物特異性結(jié)合病毒靶基因序列，經(jīng)PCR儀升溫變性、降溫退火、恒溫延伸的循環(huán)反應，實現(xiàn)靶基因片段的大量擴增。最終通過瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分離，依據(jù)特異性條帶的有無及大小判定樣本是否感染BPIV3或CPIV3，陰性對照無條帶、陽性對照出現(xiàn)特異條帶則試驗成立，樣本出現(xiàn)預期條帶即為病毒核酸陽性。
 
二、‌實驗準備
1、儀器設配
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外,其他設備和材料如下：
① Pipetty Pro 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR 儀；
③ 電泳儀和水平電泳槽；
④ 凝膠成像儀或紫外透射儀；
⑤ 臺式離心機；
⑥ 高速臺式冷凍離心機；
⑦ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
⑧ 生物安全柜。
 
2、試劑和材料
① 引物；
② BPIV3陽性對照；
③ CPIV3陽性對照；
④ 病毒RNA提取試劑盒；
⑤ 反轉(zhuǎn)錄試劑盒；
⑥ PCR預混液或一步法RT-PCR預混液；
⑦ 離心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同規(guī)格)；
⑧ PCR反應管。
 
三、實驗步驟
1、樣本經(jīng)預處理后取上清，采用Pipetty電動移液器精準移取樣本至提取管，配合病毒RNA提取試劑盒完成核酸提取。
2、用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的核酸進行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ羰褂靡徊椒≧T-PCR預混液可省略此步驟。
3、將PCR反應各試劑于冰上融化后，借助Pipetty電動移液器的高精度連續(xù)分液功能，配制RT-PCR反應體系，將cDNA模板分別加入相應PCR反應管中，同時設陽性對照和陰性對照(去離子水)，對PCR反應管進行編號。蓋緊管蓋后，500r/min離心30s。
上游引物（10 μmol/L）    0.5μL
下游引物（10 μmol/L）    0.5μL
2×PCR Mix                12.5μL
無核酶水                  9.5μL
cDNA模板                  2.0μL
總體積                    25.0μL
 
4、將加樣后的PCR反應管放入PCR儀中，按照表D.2中BPIV3或CPIV3的RT-PCR反應程序進行。若采用一步法RT-PCR預混液，可按照說明書操作。
5、 用Pipetty取PCR產(chǎn)物5uL~10uL，在1%~1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀觀察結(jié)果。
 
四、結(jié)果判定
1、陰性對照無擴增條帶，陽性對照出現(xiàn)符合大小的特異擴增條帶，判為試驗成立。
2、樣品出現(xiàn)預期大小的擴增片段時，判定為病毒核酸檢測陽性。樣品未出現(xiàn)預期大小的擴增片段，判定病毒核酸檢測陰性。BPIV3和CPIV3陽性結(jié)果對照圖分別見圖E.l和圖E.2。