登革病毒抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其抗病毒機制研究
▶ 發(fā)表時間：2025年11月29日
▶ 期刊：《MedComm 》(IF=10.7)
▶ 發(fā)表團隊：南方醫(yī)科大學余林中課題組
▶ 文章標題：Discovery ofa Novel Non-Nucleoside Inhibitor of RNA-Dependent RNA Polymerase Against Dengue Virus
▶ 核心內容：
登革病毒（DENV）是全球分布最廣的蚊媒病毒之一，每年導致數(shù)億人感染，數(shù)萬例死亡，目前尚無特異性抗病毒藥物獲批。病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）是病毒基因組復制的核心酶，因其在宿主細胞中無同源蛋白而成為理想的抗病毒靶點。近日，南方醫(yī)科大學研究團隊在《MedComm》發(fā)表論文，報道從中藥三七中分離的天然化合物12β-hydroxydammar-3-one-20(S)-O-β-D-glucopyranoside（PN-1），可特異性靶向RdRp并有效抑制病毒復制，為抗登革病毒藥物研發(fā)提供了新型先導化合物。
研究方法
研究團隊首先采用表面等離子共振技術，對14種三七來源的達瑪烷型三萜皂苷進行篩選，發(fā)現(xiàn)PN-1與DENV-2 RdRp的結合親和力最高，平衡解離常數(shù)KD 為1.42 nM。通過等溫滴定量熱法、細胞熱轉移實驗及藥物親和反應靶點穩(wěn)定性實驗，進一步證實PN-1可直接與病毒非結構蛋白5（NS5）的RdRp結構域結合，且不影響其甲基轉移酶結構域功能。
研究結果
1.PN-1通過共價修飾調控抑制RdRp活性
液相色譜-串聯(lián)質譜分析表明，PN-1通過其裂解片段共價修飾RdRp上的四個保守氨基酸殘基：Glu255、Met387、Glu479和Ala507。定點突變實驗證實，這些位點的突變顯著減弱PN-1與RdRp的結合能力(圖2.A-E)。
圖2. PN-1共價修飾到RdRp蛋白的LCMSMS譜圖
（A,C 體內非修飾肽段，B.PN-1修飾到Glu255肽段二級譜圖, D. PN-1修飾到Ala507肽段二級譜圖，E.對四個位點突變后顯著減少PN-1與RdRp蛋白結合）
2.PN-1通過構象調控抑制RdRp活性
HDX-MS氫氘交換質譜分析顯示，PN-1處理后，RdRp在多個結構區(qū)域的氫氘交換速率發(fā)生顯著變化，尤其是在拇指結構域（肽段485–501與501–505）的交換率降低，提示該區(qū)域構象趨于穩(wěn)定或封閉（圖3）。色氨酸熒光光譜也觀察到PN-1引起RdRp內源熒光猝滅，進一步支持其誘導蛋白質構象變化的結論（圖2F）。這些構象改變最終導致RdRp酶活抑制，其半抑制濃度為6.10 μM。
圖3. PN-1結合并調控RdRp構象
3.PN-1在體外與體內模型中表現(xiàn)廣譜抗病毒活性
PN-1在多種細胞系中均能顯著抑制DENV-2復制，降低病毒RNA、蛋白表達及病毒斑塊形成。作用階段分析表明，PN-1主要作用于病毒復制早期，對病毒吸附與進入過程無影響。此外，PN-1對DENV-1和DENV-3同樣具有抑制活性，提示其具備跨血清型抗病毒潛力。在ICR鼠和AG129小鼠模型中，PN-1治療能顯著緩解病毒感染引起的體重下降、臨床癥狀及組織病理損傷，并提高存活率（圖4）。在AG129小鼠中，PN-1還可降低血清病毒載量，減輕肝臟、小腸和結腸的病理損傷。
圖4. PN-1處理顯著降低因病毒DENV-2引起的AG129小鼠生存危機
4.氫氘交換質譜HDXMS在機制闡釋中的關鍵作用
本研究通過HDX-MS技術，從蛋白質構象動力學層面揭示了PN-1的作用機制。該技術通過監(jiān)測蛋白質肽鍵氫與氘的交換速率，反映蛋白質局部結構的動態(tài)性與溶劑可及性。
實驗結果顯示：
交換率降低的區(qū)域：主要位于拇指（thumb)結構域及部分指掌區(qū)，提示PN-1結合后這些區(qū)域構象更穩(wěn)定或更封閉，可能與活性口袋變構調控有關；
交換率升高的區(qū)域：分布于其他指(finger)掌(palm)區(qū)段，提示局部結構可能變得更動態(tài)或更暴露。這些數(shù)據(jù)不僅證實PN-1與RdRp發(fā)生物理結合，更重要的是闡明其通過變構調控機制改變酶的功能構象，從而抑制其催化活性。
HDX-MS所提供的動態(tài)結構信息，為理解PN-1作為非核苷類抑制劑的分子機制提供了直接證據(jù)。
PN-1作為首個被發(fā)現(xiàn)可通過共價修飾RdRp并變構調控其功能的天然來源非核苷類抑制劑，具有廣譜應用潛力。由于RdRp在RNA病毒中相對保守，提示PN-1可能對黃病毒科其他成員（如寨卡病毒、丙肝病毒）也具有抑制活性。
