肉類顏色測(cè)量指南之肉色研究方法K-P
K.骨骼肌提取物對(duì)肌紅蛋白的還原作用
原則
肌紅蛋白還原酶活性通過(guò)監(jiān)測(cè)MMb還原為DMb的過(guò)程來(lái)測(cè)定，隨后在有氧體系中快速生成OMb。
酶活性的計(jì)算依據(jù)是反應(yīng)初始線性階段（1至2分鐘）期間OMb在580 nm波長(zhǎng)處吸光度的增加。
操作步驟
1. 取5克（稱重至0.1克）不含可見脂肪或結(jié)締組織的肌肉組織樣本，將其切成小塊。
2. 將樣品在20 mL的0.2 mM磷酸鈉緩沖液（pH 5.6）中均質(zhì)化（或肌肉的pH值)持續(xù)90秒，或直至肌肉組織完全破壞。
3. 在 4°C 下使用Beckman超速離心機(jī)以35,000× g 離心30分鐘。
4. 將上清液倒入小燒杯中，用0.4微米注射器濾器過(guò)濾2-3 mL，轉(zhuǎn)移至小試管中。
5. 配制試驗(yàn)溶液：
5 mM EDTA二鈉
50 mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.65（將此pH調(diào)整至所需pH）
3.0 mM鐵氰化鉀
0.75 mM甲基肌紅蛋白（馬骨骼肌來(lái)源，貨號(hào)Sigma M-0630，或經(jīng)純化處理的豬/牛來(lái)源，
詳見純化方案）溶于30 mM磷酸鈉緩沖液
1.0 mM NADH（Sigma N-8129）
6. 打開日立UV-2010分光光度計(jì)并預(yù)熱10分鐘。
7. 如果可能，加載一個(gè)分光光度法軟件程序， 該程序可在180至240秒內(nèi)測(cè)量580 nm處的吸光
度增加 ； 否則手動(dòng)加載軟件 。
8. 將空比色皿放入分光光度計(jì)比色皿中，并將儀器歸零。
9. 向塑料微孔板中加入以下試劑量：
100 µL 5 mM EDTA
100 µL 50 mM檸檬酸鹽緩沖液
100 µL 3.0 mM鐵氰化鉀
200 0.75 mM甲基肌紅蛋白的 µL 值
200 µL 去離子水
10. 將每個(gè)微量比色皿放入分光光度計(jì)比色皿中，同時(shí)加入
100 1 mM NADH的 µL 值
200 µL 過(guò)濾后的肌肉提取物
11. 用移液管充分混勻，然后至少釋放兩次溶液。
注意：加入試劑并盡快混合，因?yàn)榉磻?yīng)會(huì)立即開始。
12. 盡快開始在580 nm處測(cè)量吸光度增加，并持續(xù)進(jìn)行
180至240秒。隨著肌紅蛋白被肌肉提取物還原，吸光度在580 nm會(huì)增加。
14. 肌紅蛋白還原酶活性的表達(dá)方式為：在時(shí)間進(jìn)程的初始線性階段（通常為 第一或前
兩分鐘），每分鐘每克肌肉中還原的肌紅蛋白納摩爾數(shù)。
樣例
如果0秒時(shí)580 nm處的吸光度為0,60秒時(shí)吸光度為0.132，則 Δ Abs580nm= 0.132/分鐘。使用比爾定律計(jì)算 甲基肌紅蛋白到氧合肌紅蛋白 的濃度變化。
A = Ebc，其中
A=吸光度（或吸光度變化）
b=路徑長(zhǎng)度（塑料微孔板為1 cm）
E=消光系數(shù)（12000）C = 濃度（mol/L） / 升 0.132=12000×1×c
c = 0.132/12000
c = 11.0 × e-6 M/分鐘/5克肌肉或11 µM /分鐘/5克肌肉
記下
記住，這里說(shuō)的是濃度變化，而不是濃度本身。
將濃度變化乘以比色皿中的體積，即可將濃度換算為摩爾。
11 e-6 mol/L/分鐘/5克 × 0.0015升 =
16.5×10^-9摩爾/分鐘/5克肌肉=
16.5 nmol每分鐘/5克肌肉=
3.3 nmol/分鐘/克肌肉
每分鐘每克肌紅蛋白的還原量為3.3 nmol，即為報(bào)告數(shù)值
記下
如果將吸光度的變化取120秒（2分鐘）的平均值，然后將最終數(shù)值 除以2 。
參考文獻(xiàn)
Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌紅蛋白還原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514.
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過(guò)近紅外血氧測(cè)定法檢測(cè)三種后強(qiáng)直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。
L.檢測(cè)變性血紅蛋白血色素的反射率
原則
變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過(guò)528和558納米處的反射峰來(lái)判斷（Ghorpade和Cornfor
th，1993）。
材料和設(shè)備
1. 白色標(biāo)準(zhǔn)品（硫酸鋇粉末）
2. 配備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品接口的記錄型分光光度計(jì)及積分球附件。
3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。
操作步驟
1. 使用白色標(biāo)準(zhǔn)品（粉狀硫酸鋇）在樣品和標(biāo)準(zhǔn) 端口的反射附件中，將記錄分光光度計(jì)的反射率從420至700nm標(biāo)準(zhǔn)化為100%。
2. 獲得3 cm × 3 cm的均勻肉片（足以完全覆蓋反射附件上的樣品端口），厚度>3 mm。
3. 為排除空氣和減少褪色，將新鮮切片迅速放入透明聚乙烯 真空袋（厚度 1 . 5mil）中。 從底部向上壓緊袋子以 消除氣泡。 測(cè)量反射率時(shí) ，樣品仍留在透明聚乙烯袋中。
4. 將裝袋樣品緊密放入反射率球的樣品口，使新鮮切片的表面朝內(nèi)（即朝向檢測(cè)器）。記錄420至700納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的表面反射率（以標(biāo)準(zhǔn)值百分比表示）。變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過(guò)528和558納米附近出現(xiàn)反射率峰值來(lái)判斷（戈?duì)柵恋潞涂蹈Ｋ?nbsp;， 1986 ； 康福斯 ， 2001）。
5. 可選:若需獲取新鮮樣本與褪色樣本的差異光譜,可將對(duì)照組肉片置于空氣中褪色15至30分鐘。
6. 將樣品裝入袋中，按新鮮樣品的描述記錄反射光譜。
7. 從新鮮樣本光譜中減去基線光譜（褪色切片）。
參考文獻(xiàn)
Cornforth，D. P. 2001. 熟肉與腌制肉色素的分光光度法及反射率測(cè)定。收錄于《食品分析化學(xué)最新實(shí)驗(yàn)指南》F3.2單元，由S. J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.出版社，紐約。
Ghorpade，V. M.和D. P. Cornforth. 1993 .在65°C或82°C下烹制的豬肉烤制過(guò)程中產(chǎn)生粉紅色的色素的光譜。J. Food Sci. 58：51-52,59。
M. nitrite熟肉分析
原則
亞硝酸鹽離子被溶入熱水中。取部分提取液與格里斯試劑（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成最大吸光度為540 nm的粉紅色偶氮染料。 粉紅色調(diào)的深淺 與 初始亞硝酸鹽濃度（按比爾定律）成正比。 樣品亞硝酸鹽濃度通過(guò)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 ，并考慮樣品稀釋倍數(shù)。
試劑和儀器
1. NED試劑：將0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要時(shí)過(guò)
濾，儲(chǔ)存在棕色玻璃瓶中。
2. 磺胺試劑：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸中，必要時(shí)過(guò)濾，置于棕色
玻璃瓶中保存。
3. 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)：
a. 貯備液：亞硝酸鈉1000ppm。取亞硝酸鈉1.0g溶于水，稀釋至1L。
b. 中間溶液：100 ppm亞硝酸鈉。取100 mL原液，加水稀釋至1 L。
c. 工作溶液：1 ppm亞硝酸鈉。取10 mL中間體溶液，用水稀釋至1 L。
4. 取3-4張濾紙，分析盒中濾紙的亞硝酸鹽污染情況。 通過(guò)每張濾紙過(guò)濾約40mL水 。 加入4mL磺胺類試劑，攪拌，靜置5分鐘，加入4毫升NED試劑，混合后靜置15分鐘。若檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，請(qǐng)丟棄整盒。
操作步驟
1. 稱取5克細(xì)碎組織，將樣本充分混勻后置于50毫升燒杯中。
2. 加入約40mL80℃水，用玻璃棒充分混勻，破碎所有塊狀物， 并轉(zhuǎn)移至500 - mL容量瓶中。
3. 用熱水分次清洗燒杯和棒，將所有洗液倒入燒瓶中。
4. 加入足量熱水，使體積達(dá)到約300mL，將燒瓶轉(zhuǎn)移至80°C 水浴 中，并靜置2小時(shí)，偶爾搖動(dòng)。
5. 冷卻至室溫，用水稀釋至體積，并再次混合。
6. 過(guò)濾，向50-50mL容量瓶中含5至50µg亞硝酸鈉的等分試樣中加入2.5mL磺胺類試劑，并混合。
7. 5分鐘后，加入2.5 mL NED試劑，混合，稀釋至體積，再次混合， 15分鐘內(nèi)顯色 。
8. 將溶液轉(zhuǎn)移至分光光度計(jì)比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺類試劑和2.5mLNED試劑的空白溶液為對(duì)照，測(cè)定 540nm 處的吸光度。
9. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：向50毫升容量瓶中分別加入10、20、30和40毫升工作硝酸鈉溶液，加入2.5毫升磺胺類試劑，混勻后按上述步驟進(jìn)行，從步驟7開始。最終溶液中硝酸鈉濃度為1ppm時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈直線。
計(jì)算
樣品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g樣品）=標(biāo)準(zhǔn)曲線給出的ppm NaNO2×50/分裝量（mL）×500/樣品重量(g)
參考
AOAC . 1990. 《熟肉中亞硝酸鹽的測(cè)定方法973.31》，載于《官方分析方法》第15版，K. Helrich主編，弗吉尼亞州阿靈頓： AOAC 出版社，第938頁(yè)。
n. 烤肉及配料的硝酸鹽分析
原則
亞硝酸鹽和硝酸鹽離子需用熱水提取。
初始亞硝酸鹽濃度通過(guò)與格里斯試劑反應(yīng)后產(chǎn)生的粉紅色（540nm 波長(zhǎng)）強(qiáng)度測(cè)定，具體方法如先前所述。測(cè)定硝酸鹽+亞硝酸鹽時(shí)，將樣品提取液與釩（III）溶液+格里斯試劑混合孵育。
酸性溶液中的釩可將所有硝酸鹽離子還原為亞硝酸鹽。隨著亞硝酸鹽生成，其會(huì)與預(yù)先存在的亞硝酸鹽一同被格里斯試劑捕獲。
硝酸鹽濃度=總亞硝酸鹽（釩測(cè)定法中硝酸鹽+亞硝酸鹽的總和）-初始亞硝酸鹽。
該方法經(jīng)過(guò)改良，將釩+格里斯試劑合并為單一溶液，并改用分光光度計(jì)比色皿進(jìn)行檢測(cè)。
程序（NEMI ，2011）
1. 將約200 mL 0.5 M鹽酸倒入一個(gè)小瓶中。
2. 將瓶子置于帶通風(fēng)罩的天平上，直接稱取約0.5g三氯化釩（III）放入瓶中（為避免其粘附在鏟
子、稱量器等上）。如果仍有未溶解的顆粒殘留，通過(guò)>2微米注射器過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。
3. 加入約0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（NED）并溶解。
記下
將打開的VCl瓶 3 放置在無(wú)水硫酸鈣等干燥劑上。VCl在潮濕空氣中會(huì) 3 釋放腐蝕性氣體，但在試劑中溶解后 將不再釋放氣體。 氯化釩不被歸類為有毒或?qū)Νh(huán)境有害（MSDS 數(shù)據(jù)），與舊方法中使用的鎘不同。
VCl 3 + Greiss試劑溶液冷藏可保存約一周，但對(duì)空氣和光線敏感，若在室溫下放置數(shù)日且未加蓋，易被氧化。
將以下體積的樣品和試劑直接混合在半微量比色皿中，或按所用儀器的細(xì)胞大小進(jìn)行比例調(diào)整。
對(duì)于1至20ppm（µg /mL）硝酸鹽氮，將20 µ L樣品與1000 µL 試劑混合。
對(duì)于1至10ppm硝酸鹽氮，使用45 µL 樣品和1000 µL 試劑。
當(dāng)硝酸鹽氮含量低于1 ppm時(shí)，使用500 µL 樣品和500 µL 試劑（注：1,000 µL =1 mL）。
（如果新批次樣品的濃度完全未知，可通過(guò)篩選幾個(gè)代表性樣品快速估計(jì)其濃度范圍。將等量樣品與試劑混合。對(duì)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品也做同樣的處理。在烘箱或熱水下對(duì)樣品進(jìn)行短暫加熱 。通過(guò)比較顏色來(lái)決定最佳濃度范圍。）
將樣品移入半微量比色皿，隨后向所有比色皿中加入試劑。蓋上蓋子，輕輕倒置以充分混合。
樣品需在室溫（20-25℃）條件下保存。顯色反應(yīng)在4-5小時(shí)后逐漸減弱，6-10小時(shí)后達(dá)到峰值。比色測(cè)定需以試劑空白（水）為對(duì)照，在 540nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行。建議將標(biāo)準(zhǔn)品與樣品共同分析，以便建立校準(zhǔn)曲線用于濃度計(jì)算。雖然4-5小時(shí)后即可進(jìn)行測(cè)量，但為確保準(zhǔn)確性，建議次日制備樣品并測(cè)定吸光度。
顏色可能可在60 ℃ 下約2小時(shí)內(nèi)顯色， 或?qū)悠坊旌嫌谛≡嚬苤?nbsp;，在約100℃下加熱10至15分鐘，使顏色完全顯色。
肉類樣品的制備采用與亞硝酸鹽測(cè)定相同的熱水萃取法。計(jì)算硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度時(shí)，需考慮樣
品的稀釋倍數(shù)。
該方法經(jīng)過(guò)輕微調(diào)整，具體說(shuō)明可參見 NEMI 官網(wǎng)（NEMI ，2011）。
參考文獻(xiàn)
多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用單一試劑測(cè)定硝酸鹽的分光光度法。分析。
Lett .36：2713—2722。
NEMI（國(guó)家環(huán)境方法索引）。2011。國(guó)家環(huán)境方法索引。2011。 https:// www.nemi.gov/ 。
o. t BARS氧化酸敗檢測(cè)法——快速濕法
原則
在硫代巴比妥酸（TBA）存在下，丙二醛和脂質(zhì)氧化的其他醛類產(chǎn)物（TBA反應(yīng)物質(zhì)； TBARS）會(huì)形成 粉色顯色劑，其最大吸收峰位于532至535 nm 。 然而 ， 在干擾性糖類存在時(shí) ， 會(huì)形成黃色顯色劑 ， 采用Tarladgis（1960）蒸餾法 可避免此現(xiàn)象。
試劑
1. TBA貯備液：0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 N 鹽酸 。
2. 100mL貯備液足以進(jìn)行20次單獨(dú)檢測(cè)。貯備液可在室溫下避光保存（封裝于鋁箔包裝容器中）。
操作步驟
1. 將目標(biāo)產(chǎn)物切碎或絞碎，稱取兩份0.5克樣品。
2. 向每個(gè)樣品中加入2.5 mL TBA貯備液，使稀釋倍數(shù)為6。混勻。
3. 將樣品置于沸水中加熱10分鐘，使用松蓋試管（圓底Pyrex 或聚丙烯離心管）。 注意： 密封蓋試管在加熱過(guò)程中可能爆裂。加熱過(guò)程中陽(yáng)性樣品會(huì)變成粉色。
4. 用自來(lái)水冷卻試管。
5. 在4 °C 下以5000× g 離心10分鐘，獲得澄清上清液。
6. 小心地將上清液的一部分移至分光光度計(jì)比色皿中，注意溶液保持澄清。
7. 在532 nm處測(cè)定上清液吸光度，空白對(duì)照為 含有所有試劑 ， 但不含肉的溶液。
8. 使用 粉色TBA顯色劑的消光系數(shù) 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu1958），
計(jì)算以ppm丙二醛表示的TBA值 ， 具體方法如下 ：
TBARS數(shù)值（mg MDA/kg）=樣品A532×（1M TBA顯色劑/156，000）×[（1mol/L/M]×（0.003L/0.5g肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，
或TBARS 值（ppm）= 樣品A A 532 ×2.77 。
參考文獻(xiàn)
Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化.方法酶學(xué).52： 302 — 304 .
Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 魚類制品酸敗度的硫代巴比妥酸法測(cè)定 .II.丙二醛的定量測(cè)定.食品技術(shù).12：9—12.
P.t BARS氧化酸敗檢測(cè)法——蒸餾法
原則
該方法中，將樣品置于水中加熱，通過(guò)蒸汽蒸餾收集揮發(fā)性丙二醛及其他TBA反應(yīng)物（TBARS）。向 蒸餾液等分試樣中加入TBA溶液，形成粉紅色TBA顯色劑 ， 通過(guò)分光光度法進(jìn)行定（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。
解決方案
1. TBA試劑：將1.44 g2-硫代巴比妥酸（分子量144.1）溶于450 mL 冰醋酸 中。 用50 - mL容量瓶定容。 攪拌后，置于暗處（用鋁箔包裝）保存。
2. 磺胺試劑：將1克磺胺溶解于含有40毫升濃鹽酸和160毫升蒸餾水的溶液中。
操作步驟
1. 將10克絞碎或切碎的肉樣與50毫升蒸餾水混合，使用Waring攪拌器。定量轉(zhuǎn)移至圓底加熱瓶（凱氏瓶），并添加47.5毫升額外水。加入2.5毫升6 N 鹽酸溶液（1,2濃縮鹽酸與水混合）。
2. 為防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加熱時(shí)起泡，可加入消泡劑（如陶氏H-10消泡劑或同類產(chǎn)品）。
3. 將燒瓶充分加熱以產(chǎn)生蒸汽。使用水冷凝蒸餾裝置，將50mL蒸餾液收集到量筒中。每份樣品所需時(shí)間約為10分鐘。
4. 將蒸餾液充分混勻，用移液管吸取5mL注入50mL帶塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 試劑 。
5. 與由5mL蒸餾水和5mLTBA試劑組成的空白混合后，將其與空白一起浸入沸水浴中，精確浸泡35分鐘。
6. 將冷卻后的樣品瓶置于自來(lái)水下靜置10分鐘。使用零點(diǎn)校準(zhǔn)的分光光度計(jì)，在538 nm處測(cè)定吸光度，以TBA-水空白為對(duì)照。
參考文獻(xiàn)
Koniecko，E. S. 1979. 《肉類化學(xué)家手冊(cè)》，第53、54和62頁(yè)。Avery Publ. Group Inc.，Wayne，NJ。
塞弗特，M.，M.C.亨特，J.P.格羅貝爾，S.M.瑞安，D.E.約翰遜，和R.A.莫德倫.2006.乳酸鉀和新鮮豬肉香腸配方對(duì)有光和無(wú)光展示貨架壽命的影響。J.Food Sci.71：C390–C394.
塔拉德吉斯、B.G.、B.M.沃茨和M.T.尤納森，1960年�！队糜诙繙y(cè)定變質(zhì)食品中丙二醛的蒸餾法》，載于《美國(guó)油脂化學(xué)學(xué)會(huì)雜志》第37卷第44–48頁(yè)。
原則
肌紅蛋白還原酶活性通過(guò)監(jiān)測(cè)MMb還原為DMb的過(guò)程來(lái)測(cè)定，隨后在有氧體系中快速生成OMb。
酶活性的計(jì)算依據(jù)是反應(yīng)初始線性階段（1至2分鐘）期間OMb在580 nm波長(zhǎng)處吸光度的增加。
操作步驟
1. 取5克（稱重至0.1克）不含可見脂肪或結(jié)締組織的肌肉組織樣本，將其切成小塊。
2. 將樣品在20 mL的0.2 mM磷酸鈉緩沖液（pH 5.6）中均質(zhì)化（或肌肉的pH值)持續(xù)90秒，或直至肌肉組織完全破壞。
3. 在 4°C 下使用Beckman超速離心機(jī)以35,000× g 離心30分鐘。
4. 將上清液倒入小燒杯中，用0.4微米注射器濾器過(guò)濾2-3 mL，轉(zhuǎn)移至小試管中。
5. 配制試驗(yàn)溶液：
5 mM EDTA二鈉
50 mM檸檬酸鈉緩沖液pH 5.65（將此pH調(diào)整至所需pH）
3.0 mM鐵氰化鉀
0.75 mM甲基肌紅蛋白（馬骨骼肌來(lái)源，貨號(hào)Sigma M-0630，或經(jīng)純化處理的豬/牛來(lái)源，
詳見純化方案）溶于30 mM磷酸鈉緩沖液
1.0 mM NADH（Sigma N-8129）
6. 打開日立UV-2010分光光度計(jì)并預(yù)熱10分鐘。
7. 如果可能，加載一個(gè)分光光度法軟件程序， 該程序可在180至240秒內(nèi)測(cè)量580 nm處的吸光
度增加 ； 否則手動(dòng)加載軟件 。
8. 將空比色皿放入分光光度計(jì)比色皿中，并將儀器歸零。
9. 向塑料微孔板中加入以下試劑量：
100 µL 5 mM EDTA
100 µL 50 mM檸檬酸鹽緩沖液
100 µL 3.0 mM鐵氰化鉀
200 0.75 mM甲基肌紅蛋白的 µL 值
200 µL 去離子水
10. 將每個(gè)微量比色皿放入分光光度計(jì)比色皿中，同時(shí)加入
100 1 mM NADH的 µL 值
200 µL 過(guò)濾后的肌肉提取物
11. 用移液管充分混勻，然后至少釋放兩次溶液。
注意：加入試劑并盡快混合，因?yàn)榉磻?yīng)會(huì)立即開始。
12. 盡快開始在580 nm處測(cè)量吸光度增加，并持續(xù)進(jìn)行
180至240秒。隨著肌紅蛋白被肌肉提取物還原，吸光度在580 nm會(huì)增加。
14. 肌紅蛋白還原酶活性的表達(dá)方式為：在時(shí)間進(jìn)程的初始線性階段（通常為 第一或前
兩分鐘），每分鐘每克肌肉中還原的肌紅蛋白納摩爾數(shù)。
樣例
如果0秒時(shí)580 nm處的吸光度為0,60秒時(shí)吸光度為0.132，則 Δ Abs580nm= 0.132/分鐘。使用比爾定律計(jì)算 甲基肌紅蛋白到氧合肌紅蛋白 的濃度變化。
A = Ebc，其中
A=吸光度（或吸光度變化）
b=路徑長(zhǎng)度（塑料微孔板為1 cm）
E=消光系數(shù)（12000）C = 濃度（mol/L） / 升 0.132=12000×1×c
c = 0.132/12000
c = 11.0 × e-6 M/分鐘/5克肌肉或11 µM /分鐘/5克肌肉
記下
記住，這里說(shuō)的是濃度變化，而不是濃度本身。
將濃度變化乘以比色皿中的體積，即可將濃度換算為摩爾。
11 e-6 mol/L/分鐘/5克 × 0.0015升 =
16.5×10^-9摩爾/分鐘/5克肌肉=
16.5 nmol每分鐘/5克肌肉=
3.3 nmol/分鐘/克肌肉
每分鐘每克肌紅蛋白的還原量為3.3 nmol，即為報(bào)告數(shù)值
記下
如果將吸光度的變化取120秒（2分鐘）的平均值，然后將最終數(shù)值 除以2 。
參考文獻(xiàn)
Hagler，L.，R. I. Coppes Jr.，和 R. H. Herman. 1979 . 甲基肌紅蛋白還原酶. J. Biol. Chem. 254：6505—6514.
Madhavi，D. L.和C. E. Carpenter. 1993 .衰老和加工影響牛肉肌肉的顏色、高鐵肌紅蛋白還原酶和耗氧量。J. Food Sci. 58： 939 -942。
Mohan，A.，M. C. Hunt，T. J. Barstow，T. A. Houser和D. M. Hueber. 2010a. 通過(guò)近紅外血氧測(cè)定法檢測(cè)三種后強(qiáng)直期骨骼肌中肌紅蛋白的氧化還原形態(tài)。Food Chem. 123 ：456—464。
L.檢測(cè)變性血紅蛋白血色素的反射率
原則
變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過(guò)528和558納米處的反射峰來(lái)判斷（Ghorpade和Cornfor
th，1993）。
材料和設(shè)備
1. 白色標(biāo)準(zhǔn)品（硫酸鋇粉末）
2. 配備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品接口的記錄型分光光度計(jì)及積分球附件。
3. 透明聚乙烯真空袋（1.5 mil厚度）。
操作步驟
1. 使用白色標(biāo)準(zhǔn)品（粉狀硫酸鋇）在樣品和標(biāo)準(zhǔn) 端口的反射附件中，將記錄分光光度計(jì)的反射率從420至700nm標(biāo)準(zhǔn)化為100%。
2. 獲得3 cm × 3 cm的均勻肉片（足以完全覆蓋反射附件上的樣品端口），厚度>3 mm。
3. 為排除空氣和減少褪色，將新鮮切片迅速放入透明聚乙烯 真空袋（厚度 1 . 5mil）中。 從底部向上壓緊袋子以 消除氣泡。 測(cè)量反射率時(shí) ，樣品仍留在透明聚乙烯袋中。
4. 將裝袋樣品緊密放入反射率球的樣品口，使新鮮切片的表面朝內(nèi)（即朝向檢測(cè)器）。記錄420至700納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的表面反射率（以標(biāo)準(zhǔn)值百分比表示）。變性珠蛋白血紅素色素的存在可通過(guò)528和558納米附近出現(xiàn)反射率峰值來(lái)判斷（戈?duì)柵恋潞涂蹈Ｋ?nbsp;， 1986 ； 康福斯 ， 2001）。
5. 可選:若需獲取新鮮樣本與褪色樣本的差異光譜,可將對(duì)照組肉片置于空氣中褪色15至30分鐘。
6. 將樣品裝入袋中，按新鮮樣品的描述記錄反射光譜。
7. 從新鮮樣本光譜中減去基線光譜（褪色切片）。
參考文獻(xiàn)
Cornforth，D. P. 2001. 熟肉與腌制肉色素的分光光度法及反射率測(cè)定。收錄于《食品分析化學(xué)最新實(shí)驗(yàn)指南》F3.2單元，由S. J. Schwartz主編，John Wiley and Sons Inc.出版社，紐約。
Ghorpade，V. M.和D. P. Cornforth. 1993 .在65°C或82°C下烹制的豬肉烤制過(guò)程中產(chǎn)生粉紅色的色素的光譜。J. Food Sci. 58：51-52,59。
M. nitrite熟肉分析
原則
亞硝酸鹽離子被溶入熱水中。取部分提取液與格里斯試劑（硫酰胺+N-（1-萘基）乙二胺）混合，生成最大吸光度為540 nm的粉紅色偶氮染料。 粉紅色調(diào)的深淺 與 初始亞硝酸鹽濃度（按比爾定律）成正比。 樣品亞硝酸鹽濃度通過(guò)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 ，并考慮樣品稀釋倍數(shù)。
試劑和儀器
1. NED試劑：將0.2 g N -（1-萘基）乙二胺-2-HCl溶于150 mL 15%（v/v）乙酸中，必要時(shí)過(guò)
濾，儲(chǔ)存在棕色玻璃瓶中。
2. 磺胺試劑：取0.5克磺胺溶于150毫升15%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸中，必要時(shí)過(guò)濾，置于棕色
玻璃瓶中保存。
3. 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)：
a. 貯備液：亞硝酸鈉1000ppm。取亞硝酸鈉1.0g溶于水，稀釋至1L。
b. 中間溶液：100 ppm亞硝酸鈉。取100 mL原液，加水稀釋至1 L。
c. 工作溶液：1 ppm亞硝酸鈉。取10 mL中間體溶液，用水稀釋至1 L。
4. 取3-4張濾紙，分析盒中濾紙的亞硝酸鹽污染情況。 通過(guò)每張濾紙過(guò)濾約40mL水 。 加入4mL磺胺類試劑，攪拌，靜置5分鐘，加入4毫升NED試劑，混合后靜置15分鐘。若檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，請(qǐng)丟棄整盒。
操作步驟
1. 稱取5克細(xì)碎組織，將樣本充分混勻后置于50毫升燒杯中。
2. 加入約40mL80℃水，用玻璃棒充分混勻，破碎所有塊狀物， 并轉(zhuǎn)移至500 - mL容量瓶中。
3. 用熱水分次清洗燒杯和棒，將所有洗液倒入燒瓶中。
4. 加入足量熱水，使體積達(dá)到約300mL，將燒瓶轉(zhuǎn)移至80°C 水浴 中，并靜置2小時(shí)，偶爾搖動(dòng)。
5. 冷卻至室溫，用水稀釋至體積，并再次混合。
6. 過(guò)濾，向50-50mL容量瓶中含5至50µg亞硝酸鈉的等分試樣中加入2.5mL磺胺類試劑，并混合。
7. 5分鐘后，加入2.5 mL NED試劑，混合，稀釋至體積，再次混合， 15分鐘內(nèi)顯色 。
8. 將溶液轉(zhuǎn)移至分光光度計(jì)比色皿中，以含45mL水、2.5mL磺胺類試劑和2.5mLNED試劑的空白溶液為對(duì)照，測(cè)定 540nm 處的吸光度。
9. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：向50毫升容量瓶中分別加入10、20、30和40毫升工作硝酸鈉溶液，加入2.5毫升磺胺類試劑，混勻后按上述步驟進(jìn)行，從步驟7開始。最終溶液中硝酸鈉濃度為1ppm時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈直線。
計(jì)算
樣品中NaNO的ppm2（µg NaNO2/g樣品）=標(biāo)準(zhǔn)曲線給出的ppm NaNO2×50/分裝量（mL）×500/樣品重量(g)
參考
AOAC . 1990. 《熟肉中亞硝酸鹽的測(cè)定方法973.31》，載于《官方分析方法》第15版，K. Helrich主編，弗吉尼亞州阿靈頓： AOAC 出版社，第938頁(yè)。
n. 烤肉及配料的硝酸鹽分析
原則
亞硝酸鹽和硝酸鹽離子需用熱水提取。
初始亞硝酸鹽濃度通過(guò)與格里斯試劑反應(yīng)后產(chǎn)生的粉紅色（540nm 波長(zhǎng)）強(qiáng)度測(cè)定，具體方法如先前所述。測(cè)定硝酸鹽+亞硝酸鹽時(shí)，將樣品提取液與釩（III）溶液+格里斯試劑混合孵育。
酸性溶液中的釩可將所有硝酸鹽離子還原為亞硝酸鹽。隨著亞硝酸鹽生成，其會(huì)與預(yù)先存在的亞硝酸鹽一同被格里斯試劑捕獲。
硝酸鹽濃度=總亞硝酸鹽（釩測(cè)定法中硝酸鹽+亞硝酸鹽的總和）-初始亞硝酸鹽。
該方法經(jīng)過(guò)改良，將釩+格里斯試劑合并為單一溶液，并改用分光光度計(jì)比色皿進(jìn)行檢測(cè)。
程序（NEMI ，2011）
1. 將約200 mL 0.5 M鹽酸倒入一個(gè)小瓶中。
2. 將瓶子置于帶通風(fēng)罩的天平上，直接稱取約0.5g三氯化釩（III）放入瓶中（為避免其粘附在鏟
子、稱量器等上）。如果仍有未溶解的顆粒殘留，通過(guò)>2微米注射器過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。
3. 加入約0 . 2g磺胺和0 . 01g N -（1-萘基）乙二胺二鹽酸鹽（NED）并溶解。
記下
將打開的VCl瓶 3 放置在無(wú)水硫酸鈣等干燥劑上。VCl在潮濕空氣中會(huì) 3 釋放腐蝕性氣體，但在試劑中溶解后 將不再釋放氣體。 氯化釩不被歸類為有毒或?qū)Νh(huán)境有害（MSDS 數(shù)據(jù)），與舊方法中使用的鎘不同。
VCl 3 + Greiss試劑溶液冷藏可保存約一周，但對(duì)空氣和光線敏感，若在室溫下放置數(shù)日且未加蓋，易被氧化。
將以下體積的樣品和試劑直接混合在半微量比色皿中，或按所用儀器的細(xì)胞大小進(jìn)行比例調(diào)整。
對(duì)于1至20ppm（µg /mL）硝酸鹽氮，將20 µ L樣品與1000 µL 試劑混合。
對(duì)于1至10ppm硝酸鹽氮，使用45 µL 樣品和1000 µL 試劑。
當(dāng)硝酸鹽氮含量低于1 ppm時(shí)，使用500 µL 樣品和500 µL 試劑（注：1,000 µL =1 mL）。
（如果新批次樣品的濃度完全未知，可通過(guò)篩選幾個(gè)代表性樣品快速估計(jì)其濃度范圍。將等量樣品與試劑混合。對(duì)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品也做同樣的處理。在烘箱或熱水下對(duì)樣品進(jìn)行短暫加熱 。通過(guò)比較顏色來(lái)決定最佳濃度范圍。）
將樣品移入半微量比色皿，隨后向所有比色皿中加入試劑。蓋上蓋子，輕輕倒置以充分混合。
樣品需在室溫（20-25℃）條件下保存。顯色反應(yīng)在4-5小時(shí)后逐漸減弱，6-10小時(shí)后達(dá)到峰值。比色測(cè)定需以試劑空白（水）為對(duì)照，在 540nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行。建議將標(biāo)準(zhǔn)品與樣品共同分析，以便建立校準(zhǔn)曲線用于濃度計(jì)算。雖然4-5小時(shí)后即可進(jìn)行測(cè)量，但為確保準(zhǔn)確性，建議次日制備樣品并測(cè)定吸光度。
顏色可能可在60 ℃ 下約2小時(shí)內(nèi)顯色， 或?qū)悠坊旌嫌谛≡嚬苤?nbsp;，在約100℃下加熱10至15分鐘，使顏色完全顯色。
肉類樣品的制備采用與亞硝酸鹽測(cè)定相同的熱水萃取法。計(jì)算硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度時(shí)，需考慮樣
品的稀釋倍數(shù)。
該方法經(jīng)過(guò)輕微調(diào)整，具體說(shuō)明可參見 NEMI 官網(wǎng)（NEMI ，2011）。
參考文獻(xiàn)
多恩，T. A.和W. R. Horwath. 2003 .用單一試劑測(cè)定硝酸鹽的分光光度法。分析。
Lett .36：2713—2722。
NEMI（國(guó)家環(huán)境方法索引）。2011。國(guó)家環(huán)境方法索引。2011。 https:// www.nemi.gov/ 。
o. t BARS氧化酸敗檢測(cè)法——快速濕法
原則
在硫代巴比妥酸（TBA）存在下，丙二醛和脂質(zhì)氧化的其他醛類產(chǎn)物（TBA反應(yīng)物質(zhì)； TBARS）會(huì)形成 粉色顯色劑，其最大吸收峰位于532至535 nm 。 然而 ， 在干擾性糖類存在時(shí) ， 會(huì)形成黃色顯色劑 ， 采用Tarladgis（1960）蒸餾法 可避免此現(xiàn)象。
試劑
1. TBA貯備液：0.375%硫代巴比妥酸、15%三氯乙酸和0.25 N 鹽酸 。
2. 100mL貯備液足以進(jìn)行20次單獨(dú)檢測(cè)。貯備液可在室溫下避光保存（封裝于鋁箔包裝容器中）。
操作步驟
1. 將目標(biāo)產(chǎn)物切碎或絞碎，稱取兩份0.5克樣品。
2. 向每個(gè)樣品中加入2.5 mL TBA貯備液，使稀釋倍數(shù)為6。混勻。
3. 將樣品置于沸水中加熱10分鐘，使用松蓋試管（圓底Pyrex 或聚丙烯離心管）。 注意： 密封蓋試管在加熱過(guò)程中可能爆裂。加熱過(guò)程中陽(yáng)性樣品會(huì)變成粉色。
4. 用自來(lái)水冷卻試管。
5. 在4 °C 下以5000× g 離心10分鐘，獲得澄清上清液。
6. 小心地將上清液的一部分移至分光光度計(jì)比色皿中，注意溶液保持澄清。
7. 在532 nm處測(cè)定上清液吸光度，空白對(duì)照為 含有所有試劑 ， 但不含肉的溶液。
8. 使用 粉色TBA顯色劑的消光系數(shù) 1.56×10^5 56×10^5 56 / M / cm（Sinnhuber和Yu1958），
計(jì)算以ppm丙二醛表示的TBA值 ， 具體方法如下 ：
TBARS數(shù)值（mg MDA/kg）=樣品A532×（1M TBA顯色劑/156，000）×[（1mol/L/M]×（0.003L/0.5g肉）×（72.07gMDA/mol MDA）×1000mg/g）×1000g/kg)，
或TBARS 值（ppm）= 樣品A A 532 ×2.77 。
參考文獻(xiàn)
Buege，J. A.和S. D. Aust. 1978 .微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化.方法酶學(xué).52： 302 — 304 .
Sinnhuber，R. O.和T. C. Yu .1958. 2 - 魚類制品酸敗度的硫代巴比妥酸法測(cè)定 .II.丙二醛的定量測(cè)定.食品技術(shù).12：9—12.
P.t BARS氧化酸敗檢測(cè)法——蒸餾法
原則
該方法中，將樣品置于水中加熱，通過(guò)蒸汽蒸餾收集揮發(fā)性丙二醛及其他TBA反應(yīng)物（TBARS）。向 蒸餾液等分試樣中加入TBA溶液，形成粉紅色TBA顯色劑 ， 通過(guò)分光光度法進(jìn)行定（Tarladgis等人 ， 1960 ； Koniecko ， 1979）。
解決方案
1. TBA試劑：將1.44 g2-硫代巴比妥酸（分子量144.1）溶于450 mL 冰醋酸 中。 用50 - mL容量瓶定容。 攪拌后，置于暗處（用鋁箔包裝）保存。
2. 磺胺試劑：將1克磺胺溶解于含有40毫升濃鹽酸和160毫升蒸餾水的溶液中。
操作步驟
1. 將10克絞碎或切碎的肉樣與50毫升蒸餾水混合，使用Waring攪拌器。定量轉(zhuǎn)移至圓底加熱瓶（凱氏瓶），并添加47.5毫升額外水。加入2.5毫升6 N 鹽酸溶液（1,2濃縮鹽酸與水混合）。
2. 為防止碰撞，可添加若干玻璃珠。若加熱時(shí)起泡，可加入消泡劑（如陶氏H-10消泡劑或同類產(chǎn)品）。
3. 將燒瓶充分加熱以產(chǎn)生蒸汽。使用水冷凝蒸餾裝置，將50mL蒸餾液收集到量筒中。每份樣品所需時(shí)間約為10分鐘。
4. 將蒸餾液充分混勻，用移液管吸取5mL注入50mL帶塞玻璃瓶中，加入5mLTBA 試劑 。
5. 與由5mL蒸餾水和5mLTBA試劑組成的空白混合后，將其與空白一起浸入沸水浴中，精確浸泡35分鐘。
6. 將冷卻后的樣品瓶置于自來(lái)水下靜置10分鐘。使用零點(diǎn)校準(zhǔn)的分光光度計(jì)，在538 nm處測(cè)定吸光度，以TBA-水空白為對(duì)照。
參考文獻(xiàn)
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塞弗特，M.，M.C.亨特，J.P.格羅貝爾，S.M.瑞安，D.E.約翰遜，和R.A.莫德倫.2006.乳酸鉀和新鮮豬肉香腸配方對(duì)有光和無(wú)光展示貨架壽命的影響。J.Food Sci.71：C390–C394.
塔拉德吉斯、B.G.、B.M.沃茨和M.T.尤納森，1960年�！队糜诙繙y(cè)定變質(zhì)食品中丙二醛的蒸餾法》，載于《美國(guó)油脂化學(xué)學(xué)會(huì)雜志》第37卷第44–48頁(yè)。
標(biāo)簽：
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