單細(xì)胞測序助力靶向Aurora激酶B調(diào)控并增強(qiáng)膽管癌化療免疫治療效果

二、摘要解讀
三、研究思路與結(jié)果解析
（一）AURKB 是膽管癌的特異性依賴靶點(diǎn)且高表達(dá)提示不良預(yù)后
研究思路  
實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 對 23 種膽管癌細(xì)胞系的 CRISPR 敲除篩選及 CERES 依賴分?jǐn)?shù)分析，篩選出 AURKB、PLK1、CDK1 等 6 個(gè)潛在激酶靶點(diǎn)，其中僅 AURKB 高表達(dá)與膽管癌患者較差總生存期顯著相關(guān)（圖 1A-C）。
2. 臨床樣本驗(yàn)證顯示，AURKB 在膽管癌組織中高表達(dá)，癌旁正常組織中幾乎不表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)（圖 1G-J）；HTVi 誘導(dǎo)的小鼠膽管癌模型（KRASG12D/sgp19、YAPS127A/myr-AKT 等）進(jìn)一步證實(shí) AURKB 僅在腫瘤組織中特異性表達(dá)（圖 1K）。
3. 表觀遺傳機(jī)制研究表明，AURKB 啟動(dòng)子區(qū)低甲基化是其高表達(dá)的關(guān)鍵原因：膽管癌組織中 AURKB 啟動(dòng)子甲基化水平顯著低于癌旁組織，且與 AURKB 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（地西他濱）處理或敲低 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 可顯著上調(diào) AURKB 的 mRNA 及蛋白表達(dá)（圖 1L-N）。

 
（二）AURKB 在膽管癌進(jìn)展中發(fā)揮不可或缺的作用
研究思路 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，AURKB 敲低或敲除可顯著抑制膽管癌細(xì)胞增殖（CCK-8 實(shí)驗(yàn)，圖 2B）、減少集落形成（圖 2C）、降低 DNA 復(fù)制能力（EdU 實(shí)驗(yàn)，圖 2D）；而 AURKB 過表達(dá)則顯著促進(jìn)細(xì)胞生長（圖 2G）。
2. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AURKB 敲低可抑制皮下移植瘤生長（圖 2E），敲除則幾乎完全阻斷 HTVi 誘導(dǎo)的膽管癌形成（圖 2J-L）；相反，AURKB 過表達(dá)顯著加速腫瘤進(jìn)展，縮短小鼠生存期（圖 2M-R）。需注意的是，AURKB 敲低細(xì)胞在培養(yǎng)過程中存在表達(dá)反彈現(xiàn)象，導(dǎo)致腫瘤部分復(fù)長，而 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的敲除可實(shí)現(xiàn)更穩(wěn)定的抑癌效果（圖 2F）。
3. 患者來源類器官模型中，AURKB 靶向 sgRNA 病毒可顯著抑制 AURKB 陽性類器官的生長及直徑增大（圖 2H-I），而對 AURKB 陰性類器官無明顯影響；激酶活性突變體（AURKBK106R）無法逆轉(zhuǎn) AURKB 敲除導(dǎo)致的生長抑制，證實(shí) AURKB 的促癌功能依賴其激酶活性。

 
（三）AURKB 通過增強(qiáng)腫瘤內(nèi)膽固醇生成促進(jìn)膽管癌進(jìn)展
研究思路 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. RNA-seq 分析顯示，AURKB 敲低后 “膽固醇代謝通路” 在 QBC939、HuCCT1 細(xì)胞中均顯著富集（圖 3A）；靶向脂質(zhì)組學(xué)證實(shí)，AURKB 敲除可顯著降低細(xì)胞內(nèi)固醇類脂質(zhì)（尤其是膽固醇）的總量及各亞型含量（圖 3B-E）。
2. Filipin III 染色（檢測細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇）及 Amplex Red 膽固醇定量實(shí)驗(yàn)顯示，AURKB 敲低或敲除可顯著降低膽管癌細(xì)胞及類器官中的膽固醇水平（圖 3F-G，補(bǔ)充圖 S4C）；AURKB 抑制劑 AZD1152 可劑量依賴性降低腫瘤膽固醇（圖 3I）；而 AURKB 過表達(dá)則顯著升高膽固醇水平（圖 3H），且該效應(yīng)依賴其激酶活性。
3. 臨床樣本及動(dòng)物模型驗(yàn)證顯示，膽管癌組織中膽固醇水平顯著高于癌旁組織（圖 3K），且與 AURKB 表達(dá)呈正相關(guān)（圖 3L）；膽固醇補(bǔ)充可緩解 AURKB 敲除對類器官生長的抑制作用（圖 3M），證實(shí) AURKB 通過促進(jìn)腫瘤內(nèi)游離膽固醇生成推動(dòng)膽管癌進(jìn)展。

 
（四）AURKB 通過增加腫瘤內(nèi)游離膽固醇損傷膽管癌抗腫瘤免疫微環(huán)境
研究思路 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. scRNA-seq 分析（KRASG12D/sgp19 模型）顯示，AURKB 敲低（shAurkb）組腫瘤浸潤 CD8+ T 細(xì)胞比例顯著升高，巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞比例降低（圖 4A-B）；CD8+ T 細(xì)胞功能分析顯示，shAurkb 組富集 “抗原呈遞”“細(xì)胞毒性” 等免疫激活通路，而對照組富集 “ATP 合成”“糖代謝” 等代謝通路（圖 4C）。
2. CD8+ T 細(xì)胞亞型分析及 pseudotime 軌跡顯示，AURKB 敲低可促進(jìn) naive T 細(xì)胞（TN）向效應(yīng) T 細(xì)胞（TE）分化，減少向耗竭 T 細(xì)胞（TEX）轉(zhuǎn)化（圖 4D）；效應(yīng)譜系中 shAurkb 組的細(xì)胞毒性評分顯著更高，而對照組的耗竭評分更高（圖 4E）。
3. 流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證顯示，shAurkb 組腫瘤中 Granzyme B+CD8+、IFNγ+CD8+ T 細(xì)胞比例顯著升高，PD-1+CD8+ T 細(xì)胞比例降低（圖 4F）；效應(yīng) T 細(xì)胞（CD44+CD62L-CD8+）比例也顯著增加；相反，AURKB 過表達(dá)則產(chǎn)生完全相反的免疫抑制效應(yīng)。
4. 機(jī)制驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，膽固醇補(bǔ)充可逆轉(zhuǎn) AURKB 敲除對 T 細(xì)胞功能的增強(qiáng)作用，而膽固醇耗竭劑（M-β-CD）則模擬 AURKB 敲除的免疫調(diào)節(jié)效果（圖 4G）；T 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與 AURKB 敲除細(xì)胞共培養(yǎng)的 CD8+ T 細(xì)胞對野生型膽管癌細(xì)胞的殺傷能力顯著增強(qiáng)，而膽固醇補(bǔ)充可阻斷該效應(yīng)（圖 4H）。高膽固醇飲食（HCD）小鼠模型進(jìn)一步證實(shí)，HCD 可逆轉(zhuǎn) AURKB 敲低的抑癌效果及對 CD8+ T 細(xì)胞功能的改善作用（圖 4L-O）。

 
（五）AURKB 通過 NCEH1 調(diào)控腫瘤內(nèi)膽固醇水平
研究思路 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 聯(lián)合分析顯示，NCEH1（中性膽固醇酯水解酶 1）是 AURKB 調(diào)控膽固醇代謝的關(guān)鍵下游靶基因：ATAC-seq 顯示 AURKB 敲除可降低 NCEH1 啟動(dòng)子區(qū)的染色質(zhì)可及性（圖 5C），RNA-seq 及 qPCR 證實(shí) AURKB 敲低或敲除顯著降低 NCEH1 的 mRNA 及蛋白表達(dá)（圖 5D-E），且該效應(yīng)依賴 AURKB 激酶活性。
2. 組蛋白修飾機(jī)制研究顯示，AURKB 可通過催化 H3S10 磷酸化，減少 H3K9me3 在 NCEH1 啟動(dòng)子區(qū)的富集（ChIP-qPCR，圖 5L）；同時(shí)，AURKB 促進(jìn) H3K9me3S10ph（H3K9me3 與 H3S10ph 的組合修飾）的形成，該修飾無法與 HP1 復(fù)合物結(jié)合，從而解除 H3K9me3 對 NCEH1 的轉(zhuǎn)錄抑制（圖 5N）。
3. 功能驗(yàn)證顯示，NCEH1 過表達(dá)可挽救 AURKB 敲除導(dǎo)致的膽固醇水平降低（圖 5H）及腫瘤生長抑制；而 NCEH1 敲低則顯著逆轉(zhuǎn) AURKB 過表達(dá)誘導(dǎo)的膽固醇積累及免疫抑制（補(bǔ)充圖 S12E-I）。臨床樣本中，NCEH1 在膽管癌組織中高表達(dá)，且與 AURKB、H3K9me3S10ph 表達(dá)呈正相關(guān)（圖 5I、P）。

 
（六）靶向 AURKB 或降低腫瘤膽固醇可增強(qiáng)膽管癌化療免疫治療敏感性
研究思路 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AZD1152 與吉西他濱、順鉑聯(lián)合使用對膽管癌細(xì)胞具有協(xié)同細(xì)胞毒性，顯著降低化療藥物的 IC50 值（圖 7A-B）；低劑量組合即可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且 AURKB 敲低可增強(qiáng)膽管癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。
2. 患者來源類器官及 PDX 模型顯示，AZD1152 可顯著抑制 AURKB 陽性類器官的生長（圖 7D），在 PDX 模型中，AZD1152 與吉西他濱聯(lián)合治療的抑瘤效果顯著優(yōu)于單藥治療（圖 7G-H），且僅 AZD1152 可降低腫瘤內(nèi)膽固醇水平（圖 7I）。
3. 免疫聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)顯示，AZD1152 與抗 PD-1 抗體聯(lián)合可顯著抑制免疫 competent 小鼠的膽管癌進(jìn)展，增加腫瘤內(nèi) CD8+ T 細(xì)胞浸潤及細(xì)胞毒性，減少耗竭表型（圖 7Q）；辛伐他汀（膽固醇降低藥物）可模擬 AZD1152 的作用，顯著抑制腫瘤進(jìn)展并增強(qiáng)化療免疫治療效果（圖 8A-F）。
4. 臨床樣本分析顯示，化療免疫治療后無復(fù)發(fā)的膽管癌患者腫瘤內(nèi) AURKB、NCEH1、H3K9me3S10ph 表達(dá)及膽固醇水平顯著更低，CD8+ T 細(xì)胞功能更強(qiáng)（圖 7J-L），進(jìn)一步驗(yàn)證了 AURKB - 膽固醇 - 免疫抑制軸的臨床意義。

 
⭐⭐四、LabEx 單細(xì)胞測序技術(shù)的關(guān)聯(lián)與應(yīng)用⭐⭐ （一）技術(shù)應(yīng)用場景 （二）關(guān)鍵結(jié)果產(chǎn)出

1. 免疫細(xì)胞亞型分類與比例變化：通過 scRNA-seq 共鑒定出 12 種免疫細(xì)胞亞型（包括 T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等），發(fā)現(xiàn) shAurkb 組 CD8+ T 細(xì)胞比例顯著升高，巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞比例降低（圖 4A，補(bǔ)充圖 S5A-B）；對 T 細(xì)胞進(jìn)一步分群，鑒定出 11 個(gè) T 細(xì)胞亞型，其中 CD8+ T 細(xì)胞為主要群體，且 shAurkb 組效應(yīng) CD8+ T 細(xì)胞（TE）比例升高，耗竭 CD8+ T 細(xì)胞（TEX）比例降低（圖 4B，補(bǔ)充圖 S5C-D）。
2. CD8+ T 細(xì)胞功能與分化軌跡分析：通過基因集富集分析（GSEA）發(fā)現(xiàn)，shAurkb 組 CD8+ T 細(xì)胞富集 “免疫激活”“細(xì)胞毒性” 相關(guān)通路（如抗原呈遞、IFNγ 信號），而對照組富集 “代謝相關(guān)通路”（圖 4C，補(bǔ)充圖 S5I）；利用 Slingshot 工具進(jìn)行 pseudotime 軌跡分析，顯示 shAurkb 組可促進(jìn) naive CD8+ T 細(xì)胞向效應(yīng)譜系（TN-TEM-TE）分化，減少向耗竭譜系（TN-TEM-TEX）轉(zhuǎn)化（圖 4D）；通過 AddModuleScore 函數(shù)計(jì)算細(xì)胞毒性評分（Gzmb、Ifng 等基因）及耗竭評分（Pdcd1、Ctla4 等基因），證實(shí) shAurkb 組效應(yīng)譜系的細(xì)胞毒性評分更高，對照組耗竭評分更高（圖 4E，補(bǔ)充圖 S5K）。

（三）對應(yīng)實(shí)驗(yàn)圖