Cytation 多模式平臺在光敏劑抗氧化活性檢測中的新應(yīng)用
AOP1 光激活細(xì)胞系統(tǒng)技術(shù)用于天然抗氧化物篩選
自然界賦予了植物豐富的抗氧化資源，長久以來，學(xué)術(shù)界及工業(yè)界都在不懈地從這些綠色寶藏中尋找能夠?qū)棺杂苫鶕p傷、延緩衰老甚至治療疾病的“圣杯”。然而，大多數(shù)現(xiàn)有的評價體系基于試管內(nèi)生化水平的檢測，無法準(zhǔn)確反映活體或者活細(xì)胞條件下抗氧化劑的真實效能。目前唯一在細(xì)胞模型上使用的 ROS 生物傳感器是二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），但是使用該方法也有很多局限性，比如無法區(qū)分抗氧化性和細(xì)胞毒性等；而采用全新AOP1光激活細(xì)胞系統(tǒng)（Light Up cell System，LUCS）技術(shù)，能夠很好的彌補(bǔ)這一缺憾，在活細(xì)胞水平精細(xì)檢測ROS的產(chǎn)生。
什么是 AOP1 技術(shù)
AOP1 檢測方法基于一種光激活光敏劑噻唑橙（Thiazole orange，TO），它能夠釋放與細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS 的實際濃度相關(guān)的信號。檢測原理如下圖 1 所示：1) 光誘導(dǎo)前，噻唑橙（TO）加入細(xì)胞后被外排轉(zhuǎn)運蛋白排出細(xì)胞；2) 光照下，TO將能量轉(zhuǎn)移給三重態(tài)的分子氧，生成單線態(tài)氧和自由基（ROS）；3) ROS改變TO的外排和其他細(xì)胞功能；4) TO進(jìn)入細(xì)胞核后增加熒光發(fā)射信號強(qiáng)度。加入抗氧化劑后，抗氧化劑抑制ROS的產(chǎn)生， 保持TO在細(xì)胞外從而降低熒光信號，通過這個原理可以用于篩選評價抗氧化藥物的作用效果。
自然界賦予了植物豐富的抗氧化資源，長久以來，學(xué)術(shù)界及工業(yè)界都在不懈地從這些綠色寶藏中尋找能夠?qū)棺杂苫鶕p傷、延緩衰老甚至治療疾病的“圣杯”。然而，大多數(shù)現(xiàn)有的評價體系基于試管內(nèi)生化水平的檢測，無法準(zhǔn)確反映活體或者活細(xì)胞條件下抗氧化劑的真實效能。目前唯一在細(xì)胞模型上使用的 ROS 生物傳感器是二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），但是使用該方法也有很多局限性，比如無法區(qū)分抗氧化性和細(xì)胞毒性等；而采用全新AOP1光激活細(xì)胞系統(tǒng)（Light Up cell System，LUCS）技術(shù)，能夠很好的彌補(bǔ)這一缺憾，在活細(xì)胞水平精細(xì)檢測ROS的產(chǎn)生。
什么是 AOP1 技術(shù)
AOP1 檢測方法基于一種光激活光敏劑噻唑橙（Thiazole orange，TO），它能夠釋放與細(xì)胞產(chǎn)生的 ROS 的實際濃度相關(guān)的信號。檢測原理如下圖 1 所示：1) 光誘導(dǎo)前，噻唑橙（TO）加入細(xì)胞后被外排轉(zhuǎn)運蛋白排出細(xì)胞；2) 光照下，TO將能量轉(zhuǎn)移給三重態(tài)的分子氧，生成單線態(tài)氧和自由基（ROS）；3) ROS改變TO的外排和其他細(xì)胞功能；4) TO進(jìn)入細(xì)胞核后增加熒光發(fā)射信號強(qiáng)度。加入抗氧化劑后，抗氧化劑抑制ROS的產(chǎn)生， 保持TO在細(xì)胞外從而降低熒光信號，通過這個原理可以用于篩選評價抗氧化藥物的作用效果。
圖1：AOP1檢測原理示意圖
如何開展AOP1的檢測？
對于光敏劑的檢測，傳統(tǒng)的方法，需要外部光源提供持續(xù)高能光照閃爍以實現(xiàn)光誘導(dǎo)，并沒有合適的設(shè)別開展針對光敏劑的微孔板體系的高通量檢測，而安捷倫 BioTek Cytation 5 多模式細(xì)胞成像系統(tǒng)具有獨特的顯微成像和微孔板讀數(shù)雙平臺，可以在一臺設(shè)備內(nèi)為微孔板樣品提供基于 LED 燈的光源照射，以及基于高能氙燈的熒光強(qiáng)度檢測。正因為這樣靈巧的設(shè)計，能夠以“即插即用”模式實現(xiàn)便捷的 AOP1 高通量檢測（圖 2）。
圖 2：Cytation 系列產(chǎn)品的巧妙設(shè)計用于支持 AOP1 檢測
AOP1 活細(xì)胞水平評價抗氧化物活性案例
我們用一個小案例來展示使用 Cytation 多模式平臺開展活細(xì)胞水平的抗氧化活性評價，本實驗采用 HepG2 細(xì)胞系進(jìn)行檢測，細(xì)胞在 37 °C、5% CO2下培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)移到 96 孔微孔板中。試驗方案中加入不同濃度的槲皮素（1.95 至 500 微摩爾）藥物處理 4 小時后，將 AOP1 檢測試劑盒（編號 K-1001，來自 Anti Oxidant Power）的溶液 A 添加到待測樣本孔中，在 37 ℃，5% CO2中孵育 30 分鐘。孵育后，采用 Cytation5 平臺的兩步法，每 2 分鐘動態(tài)測量一次 AOP1 的熒光信號強(qiáng)度。
Cytation5 & Gen5 設(shè)置 AOP1 檢測程序
Gen5 軟件采用 Agilent BioTek 特有的 StepWise 程序編輯流程，能夠靈活的將多功能微孔板檢測步驟和熒光顯微成像步驟組合在一次實驗程序設(shè)置中，正由于這個優(yōu)勢，可以非常便捷的通過兩步法，實現(xiàn)AOP1的抗氧化能力測定（圖3）。
Step1:
使用 505 nm 激發(fā)和 535 nm 發(fā)射波長測量 AOP1 初始熒光強(qiáng)度
Step2:
設(shè)計動力學(xué)讀數(shù)模塊，立即用 Cytation 5 成像模式的 GFP LED 光源，在強(qiáng)度 1 的條件下照射 500 毫秒。這個熒光讀數(shù)/照明周期設(shè)置為相同的 18 次重復(fù)，用于獲得動力學(xué)讀數(shù)曲線。
如果需要，還可以使用 Cytation5 的無標(biāo)記成像模式對孔板內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，用于結(jié)果的均一化，獲得更可靠的數(shù)據(jù)。
圖 3：Cytation5 & Gen5 AOP1 檢測流程示意圖
數(shù)據(jù)分析
細(xì)胞抗氧化指數(shù)，Cellular antioxidant index (CAI) 的計算采用每個樣品標(biāo)準(zhǔn)化后的動力學(xué)曲線積分結(jié)果，計算公式 CAI = 1000 - (X ∙ 1000) CTL，其中 X 是 X 是標(biāo)準(zhǔn)化的相對熒光強(qiáng)度（RFU），CTL 是標(biāo)準(zhǔn)化對照孔的平均值。計算 CAI 值后，采用非線性回歸模型（Sigmoid 擬合）計算 EC50 值。
實驗結(jié)果
使用 Cytation5 的兩步法 AOP1 檢測，能夠動態(tài)監(jiān)測 TO 熒光的變化。這些數(shù)據(jù)可以被標(biāo)準(zhǔn)化，以便更容易地在實驗之間進(jìn)行比較，如圖 4 所示。TO 濃度的輕微差異、細(xì)胞數(shù)量的不同以及細(xì)胞類型的差異都可能導(dǎo)致原始熒光信號的變化。每次熒光動力學(xué)測定的結(jié)果都?xì)w一化為未處理對照組最后一次動力學(xué)測定的平均值（假定這是最高的原始信號），并表示為百分比。這種分析方法可以用于比較不同實驗中對照樣本與實驗樣本之間 ROS 活性抑制的時間或程度。
圖 4：將熒光數(shù)據(jù)繪制為時間的函數(shù)用歸一化積分計算細(xì)胞抗氧化指數(shù)（CAI）
歸一化后的數(shù)據(jù)可以在測量后進(jìn)一步分析，通過計算數(shù)據(jù)曲線下的面積（AUC）或數(shù)據(jù)的積分，可以為每個處理濃度計算一個 CAI 值。這些數(shù)據(jù)可以用四參數(shù)擬合確定 EC50 值。圖 5 展示了兩次獨立的槲皮素EC50值的測定。
從結(jié)果看，槲皮素的 EC50 值分別在兩塊不同的板上測定為 15.70 和 15.78 μM，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為 0.996 和 0.994，這些數(shù)據(jù)展示了使用 Cytation 平臺開展 AOP1 實驗的可靠性和重復(fù)性，這些結(jié)果與先前發(fā)表的數(shù)據(jù)（槲皮素 EC50 = 23.66 μM，R2 = 0.985）一致。
圖5：計算化合物劑量效應(yīng)曲線，并計算EC50用于對比不同化合物的作用效果
Cytation 平臺開展 AOP1 抗氧化活性評價檢測的優(yōu)勢：打破傳統(tǒng)，化繁為簡，性能優(yōu)異，無限拓展
由于 AOP1 檢測需要高強(qiáng)度的光線來實現(xiàn)光激活，并且需要動力學(xué)讀數(shù)檢測，此前 AOP1 這類光敏劑的實驗的數(shù)據(jù)是使用專門的閃光燈照射器獲得，并且操作起來相當(dāng)繁瑣，每次進(jìn)行光照時，都需要將微孔板從讀板機(jī)中取出，并手動移動到光源處。然而，Cytation 系列的巧妙設(shè)計能夠同時進(jìn)行顯微熒光成像和傳統(tǒng)的熒光強(qiáng)度檢測，顯微成像模塊提供了一個聚焦的、特定波長的、高能量的光線來激發(fā)熒光分子，開展 AOP1 檢測時無需反復(fù)取出樣本，為 AOP1 檢測提供了全新的方案。
此外 Cytation 系列平臺支持高通量檢測，可配置完善的活細(xì)胞檢測裝置，適用于 96 孔和 384 孔微孔板中的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，適合高通量抗氧化物的篩選方案，其出色的多模式平臺還可以用于后續(xù)的藥物靶點及毒性評價相關(guān)實驗的開展。
相關(guān)產(chǎn)品：
Cytation 5 細(xì)胞成像多功能微孔板檢測系統(tǒng)
關(guān)于安捷倫細(xì)胞分析
安捷倫細(xì)胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
安捷倫細(xì)胞分析平臺包括xCELLigence RTCA實時細(xì)胞分析儀、NovoCyte系列流式細(xì)胞儀、Seahorse能量代謝分析儀以及Synergy系列微孔板檢測儀和Cytation 系列（共聚焦）細(xì)胞成像多功能微孔板檢測儀。安捷倫細(xì)胞分析平臺聚焦基礎(chǔ)科研與細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品的開發(fā)全流程，作為適配新一代療法的強(qiáng)大分析工具，提供多方位的細(xì)胞效力檢測和深度的細(xì)胞分析，并致力于研發(fā)、生產(chǎn)質(zhì)控以及臨床的全方位檢測與分析方案開發(fā)。
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