單細(xì)胞多組學(xué)研究之單細(xì)胞譜系示蹤分析方法及應(yīng)用

今天繼續(xù)為大家分享單細(xì)胞組學(xué)的研究方法。
希望對(duì)大家的科研工作有所助益！

按照綜述《Single-cell lineage tracing approaches to track kidney cell development and maintenance》中綜述并整合了單細(xì)胞譜系追蹤的方法，將其分為四大類(lèi)（[CRISPR]/CRISPR-associated protein 9 [Cas9]-based、轉(zhuǎn)座子方法、Polylox 方法以及天然條形碼方法）。

1. CRISPR/Cas9-based 方法

• 該方法利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生可記錄的“遺傳傷痕”（genetic scars），這些變化會(huì)被穩(wěn)定地傳遞給子細(xì)胞。
• 常用的設(shè)計(jì)是把一個(gè)人工合成的“條形碼序列”插入基因組，然后在發(fā)育過(guò)程中利用Cas9 持續(xù)或間歇性切割該序列，產(chǎn)生不同的突變模式（如缺失、插入等）。
• 之后通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序讀取這些條形碼，分析細(xì)胞之間的譜系關(guān)系。

2. Transposon-based 方法

• 利用轉(zhuǎn)座子（如 Sleeping Beauty、PiggyBac）在基因組中隨機(jī)插入含有條形碼的序列。
• 每次插入事件的位點(diǎn)和條形碼組成是獨(dú)特的，因此可以作為細(xì)胞身份的遺傳標(biāo)記。
• 條形碼可通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序讀取，用于譜系重建。

3.Polylox-based 方法

• 基于Cre 重組酶和多重 loxP 位點(diǎn)的組合重組技術(shù)（Polylox 系統(tǒng)）。
• 在一個(gè)人工構(gòu)建的DNA 模塊中，多個(gè) loxP 位點(diǎn)以不同方向排列，當(dāng) Cre 重組酶作用時(shí)，模塊會(huì)發(fā)生多種可能的重排，從而生成獨(dú)特的 DNA 序列組合作為條形碼。
• 這些組合在細(xì)胞分裂過(guò)程中穩(wěn)定遺傳，可用于譜系分析。

4. Native barcoding 方法

• 不依賴(lài)外源基因編輯，而是利用細(xì)胞天然存在的變異模式（如線粒體 DNA 突變、內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子插入、單核苷酸變異）作為天然“條形碼”。
• 在單細(xì)胞測(cè)序時(shí)直接檢測(cè)這些遺傳變異，推斷譜系關(guān)系。

我們接下來(lái)看幾篇最近發(fā)表的文章，看下單細(xì)胞中譜系示蹤是如何運(yùn)用的。

2025 年在《Cell Reports》發(fā)表的《Dual-nuclease single-cell lineage tracing by Cas9 and Cas12a》，文中介紹了新開(kāi)發(fā)的DuTracer 系統(tǒng)，這是一種先進(jìn)的基因記錄系統(tǒng)，整合了 Cas9 和 Cas12a，用于單細(xì)胞水平的譜系追蹤和轉(zhuǎn)錄組分析。其具有雙核酸酶基因條形碼和譜系追蹤方法，能減少位點(diǎn)間缺失，在小鼠類(lèi)胚體（EB）和神經(jīng)中胚層類(lèi)器官（NMO）分化中的應(yīng)用，揭示了譜系層次結(jié)構(gòu)，闡明了細(xì)胞命運(yùn)決定中復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如識(shí)別出轉(zhuǎn)錄因子Foxb1在神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞（NMP）命運(yùn)決定中的作用，還能區(qū)分心臟細(xì)胞起源等。

DuTracer 是一種整合了 Cas9 和 Cas12a 兩種正交 CRISPR 核酸酶的單細(xì)胞譜系追蹤技術(shù)，其核心是通過(guò) Tet-On 和 4-OHT-ERT 誘導(dǎo)系統(tǒng)分別調(diào)控兩種核酸酶的編輯事件，減少傳統(tǒng)單一核酸酶系統(tǒng)中因多位點(diǎn)同時(shí)切割導(dǎo)致的跨位點(diǎn)缺失，同時(shí)在細(xì)胞中插入含 14bp 整合條形碼（intBC）的多拷貝靶標(biāo)陣列以區(qū)分不同整合位點(diǎn)、提升條形碼多樣性；該系統(tǒng)包含雙核酸酶質(zhì)粒（含 Cas9-ERT2 和 Cas12a 編碼區(qū)）、靶物質(zhì)粒（mCherry 3'UTR 含 4 個(gè)靶標(biāo)）及 gRNA 質(zhì)粒（表達(dá) sgRNA 和 crRNA）。

圖 1 DuTracer 產(chǎn)生的位點(diǎn)間缺失最少

一、HEK293T 細(xì)胞中 DuTracer 的譜系重建能力評(píng)估（對(duì)應(yīng)圖 2）
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
構(gòu)建含高拷貝記錄位點(diǎn)的 HEK293T 細(xì)胞系，從 10 個(gè)細(xì)胞起始，先誘導(dǎo) Cas12a 表達(dá) 22 天，再誘導(dǎo) Cas9 表達(dá) 6 天（圖 2A），通過(guò)單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）和擴(kuò)增子測(cè)序重建細(xì)胞譜系。

作者發(fā)現(xiàn)了：
譜系樹(shù)深度提升：
優(yōu)勢(shì)克�。ê�近 2800 個(gè)細(xì)胞）的譜系樹(shù)平均深度達(dá) 5 層（圖 2B）。通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)顯示，在相同靶標(biāo)數(shù)量下，雙核酸酶系統(tǒng)（Cas9+Cas12a）比單核酸酶系統(tǒng)（僅 Cas9 或 Cas12a）能重建更深的譜系樹(shù)（圖 2E），因獨(dú)立編輯事件可覆蓋更多細(xì)胞分裂階段。

靶標(biāo)陣列拷貝數(shù)的影響：
細(xì)胞平均含 22 個(gè)整合條形碼（intBCs，對(duì)應(yīng) 88 個(gè)靶標(biāo)），但譜系樹(shù)深度在 10 個(gè) intBCs 時(shí)達(dá)到平臺(tái)期（圖 2G）。Cas12a 因編輯速度快，在 10 個(gè) intBCs 時(shí)飽和；而 Cas9 編輯較慢，在 22 個(gè) intBCs 時(shí)飽和（圖 2H、I），提示不同編輯效率的核酸酶需匹配不同靶標(biāo)拷貝數(shù)。

突變模式驗(yàn)證：
多數(shù)插入 / 缺失（indels）發(fā)生在單個(gè)靶標(biāo)內(nèi)，位點(diǎn)間缺失極少，證實(shí) DuTracer 減少信息丟失的有效性。

圖2 HEK293T中DuTracer譜系重建能力評(píng)價(jià)

二、小鼠類(lèi)胚體（EB）中 DuTracer 的條形碼能力與心臟細(xì)胞起源區(qū)分
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
通過(guò)懸滴法誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）形成 EB，采用 6 種不同誘導(dǎo)策略（起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間不同），追蹤 14 天內(nèi)的分化過(guò)程（圖 3B）。

作者發(fā)現(xiàn)了：
細(xì)胞類(lèi)型與分化偏向：
EB 分化為 6 種主要細(xì)胞類(lèi)型（原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞、神經(jīng)元、腸道細(xì)胞、心臟細(xì)胞等），中胚層（尤其心臟譜系）占主導(dǎo)（圖 3C、D）。

條形碼容量限制：
Cas12a 的條形碼多樣性（熵值）高于 Cas9（圖 3E），且條形碼熵與突變 UMI 分?jǐn)?shù)呈強(qiáng)線性相關(guān)（圖 3F），提示系統(tǒng)存在理論最大條形碼容量。譜系樹(shù)深度與條形碼熵正相關(guān)（圖 3I），且在 D8a 和 D10a 樣本中最深（圖 3H）。

心臟細(xì)胞起源區(qū)分：
通過(guò)單細(xì)胞信息增益（scInfoGain）分析，發(fā)現(xiàn) cardiopharyngeal 中胚層（CPM）與心臟細(xì)胞的譜系關(guān)聯(lián)性（圖 4D），并基于克隆關(guān)系將心臟細(xì)胞分為第一心臟場(chǎng)（FHF）和第二心臟場(chǎng)（SHF）來(lái)源（圖 4F）。SHF 來(lái)源細(xì)胞高表達(dá)特定基因（如 Isl1、Six1），且與 CPM 共享轉(zhuǎn)錄特征（圖 4G）。

圖3 DuTracer顯示小鼠胚樣體中受限的條形碼容量

圖4 譜系追蹤區(qū)分心臟細(xì)胞的起源

三、小鼠神經(jīng)中胚層類(lèi)器官（NMO）中 NMPs 的譜系偏向與分子機(jī)制
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
從小鼠 ESCs 誘導(dǎo)神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞（NMPs），形成 NMOs，追蹤早期 NMPs（D3）和晚期 NMOs（D15）的克隆關(guān)系（圖 5B）。

作者發(fā)現(xiàn)了：
關(guān)鍵結(jié)果：
細(xì)胞命運(yùn)偏向：
D3 以 NMPs 為主，D15 主要為脊髓神經(jīng)細(xì)胞和中胚層細(xì)胞（如肌節(jié)、肌祖細(xì)胞）�？寺》治鲲@示，NMP 克隆在 D15 表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)或中胚層分化偏向（圖 5G、H），例如某克隆含 900 個(gè)細(xì)胞，多數(shù)為肌節(jié)和肌祖細(xì)胞。

Foxb1 的作用鑒定：
通過(guò)比較神經(jīng)偏向與中胚層偏向的 NMPs，發(fā)現(xiàn) Foxb1 在神經(jīng)偏向細(xì)胞中高表達(dá)（圖 6E、F）。敲低 Foxb1 后，NMO 體積變小，神經(jīng)基因（Pax3、Pax6）下調(diào)，中胚層基因（T、Foxc1）上調(diào)（圖 6G、H），證實(shí) Foxb1 促進(jìn) NMP 向神經(jīng)譜系分化。

圖5 譜系追蹤揭示了NMP的命運(yùn)偏差

圖 6 DuTracer 有助于發(fā)現(xiàn)命運(yùn)偏向的分子驅(qū)動(dòng)因素

當(dāng)然，也有一些文章直接利用了不依賴(lài)外源基因編輯的方法，在《Genome Biology》上發(fā)表的《Clonal expansion dictates the efficacy of mitochondrial lineage tracing in single cells》中，作者結(jié)合計(jì)算建模和單細(xì)胞組學(xué)，探究線粒體 DNA（mtDNA）變體作為譜系追蹤標(biāo)記的有效性。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)亞群特異性變體（SSVs） 是初始細(xì)胞中預(yù)先存在的異質(zhì)性，而非分裂過(guò)程中的新生突變；線粒體譜系追蹤的效能高度依賴(lài)克隆擴(kuò)增程度，在弱克隆擴(kuò)增下區(qū)分真實(shí)譜系的能力有限，而在強(qiáng)克隆擴(kuò)增（如疾病狀態(tài)下的 T 細(xì)胞擴(kuò)增、衰老個(gè)體的克隆造血）中，部分高頻率且穩(wěn)定的 SSVs 可有效標(biāo)記細(xì)胞譜系；同時(shí)，研究引入譜系信息評(píng)分（LIS），助力在不同單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)中識(shí)別可靠的線粒體譜系追蹤標(biāo)記。

譜系信息評(píng)分（LIS）對(duì)線粒體譜系追蹤應(yīng)用的推動(dòng)作用
在不同生物學(xué)場(chǎng)景中識(shí)別出的亞群特異性變體（SSVs）在標(biāo)記細(xì)胞譜系時(shí)表現(xiàn)出顯著不同的效能，因此迫切需要一種方法來(lái)識(shí)別真正具有譜系信息的線粒體 DNA（mtDNA）突變�；�于模擬實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，作者嘗試引入一種定量指標(biāo)，用于在單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)中篩選可靠的譜系信息性 mtDNA 變體。

顯然，若一個(gè) mtDNA 變體在某一細(xì)胞亞群中呈固定狀態(tài)（變異等位基因頻率 VAF 接近 100%，即亞克隆純合性），它就能像核基因組變體一樣長(zhǎng)期穩(wěn)定標(biāo)記該亞群。但亞克隆純合性非常罕見(jiàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)亞克隆變體在細(xì)胞內(nèi)呈異質(zhì)性狀態(tài)。因此，作者定義了 “譜系信息評(píng)分（LIS）” 來(lái)量化 SSVs 作為可靠譜系標(biāo)記的能力，計(jì)算公式為：

 

其中，Mean (VAF) 和 Var (VAF) 分別表示在檢測(cè)到該變體的細(xì)胞中觀察到的 VAF 平均值和方差。LIS 越高，表明該 mtDNA 變體作為細(xì)胞譜系標(biāo)記的可靠性越強(qiáng)。為確定 LIS 的實(shí)用閾值，作者還繪制了精確度 - 閾值曲線（方法部分詳述）。分析顯示，在模擬數(shù)據(jù)中，當(dāng) LIS 閾值設(shè)為約 0.6（0.58）時(shí)，精確度可達(dá) 80%（圖 4a）。超過(guò)該閾值后，精確度的提升幅度會(huì)大幅降低。

值得注意的是，高 LIS 的 SSV 定義亞群的祖先世代顯著大于低 LIS 的亞群（圖 2-1b），這表明 0.6 這一閾值確實(shí)可用于 SSVs 的分類(lèi)。隨后，作者通過(guò)調(diào)整參數(shù)（包括不同的 mtDNA 拷貝數(shù)（500、750、1000）、每堿基對(duì)每細(xì)胞分裂的 mtDNA 突變率（μ=10−8、5×10 −8或10−7）以及擴(kuò)增強(qiáng)度（τ=0.1、0.5 和 0.9））生成更多模擬數(shù)據(jù)，以測(cè)試 LIS 閾值的穩(wěn)健性。結(jié)果表明，當(dāng)前的 LIS 閾值（0.6）在不同設(shè)置下均能達(dá)到較高的精確度（>80%），穩(wěn)健性良好（圖 4c）。因此，在后續(xù)的單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)分析中，作者采用 LIS≥0.6 來(lái)篩選優(yōu)質(zhì) SSVs。

真實(shí)數(shù)據(jù)中 LIS 的應(yīng)用驗(yàn)證
作者進(jìn)一步將 LIS 應(yīng)用于真實(shí)數(shù)據(jù)，以識(shí)別潛在的譜系信息性標(biāo)記。首先分析了之前生成的單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集來(lái)自 4 名年輕供體（22-24 歲）的外周血單核細(xì)胞（PBMC），包含單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、染色質(zhì)可及性和 mtDNA 突變圖譜。由于這些供體年齡較小，克隆造血（造血過(guò)程中典型的克隆擴(kuò)增過(guò)程）的可能性較低，因此該數(shù)據(jù)集可作為弱擴(kuò)增的實(shí)例。作者在單細(xì)胞水平檢測(cè) mtDNA 突變，每個(gè)細(xì)胞的線粒體基因組覆蓋度約為 20×。隨后，利用染色質(zhì)可及性信息注釋細(xì)胞類(lèi)型，成功注釋出 PBMC 中常見(jiàn)的各類(lèi)細(xì)胞（圖 2-1d）。作者識(shí)別出 SSVs 并計(jì)算每個(gè) SSV 定義亞群的 LIS（圖 2-1e）。由于該數(shù)據(jù)集缺乏真實(shí)譜系信息，作者通過(guò)檢測(cè)每個(gè) SSV 定義亞群內(nèi)的細(xì)胞類(lèi)型相似性來(lái)評(píng)估。在這些年輕供體樣本中，未發(fā)現(xiàn)大量超過(guò) LIS 閾值（0.6）的 SSVs，這與 PBMC 中較低的克隆擴(kuò)增水平一致。值得注意的是，每個(gè) SSV 定義的亞群內(nèi)均觀察到高度的細(xì)胞類(lèi)型多樣性（圖 2-1e-g）。在所有 3 名供體中均觀察到類(lèi)似結(jié)果，但在年輕供體 4 中發(fā)現(xiàn)了少數(shù)高 LIS 的 SSVs（35 個(gè) SSVs 中有 2 個(gè)），表明即使在年輕時(shí)也可能存在克隆擴(kuò)增。

同時(shí)作者還收集了 2 名 70 歲以上老年供體（1 名男性和 1 名女性）的 PBMC 樣本，因?yàn)榭寺≡煅�在老年人中更為常�?jiàn)。通過(guò)對(duì)這兩名個(gè)體的 PBMC 樣本進(jìn)行了 mtscATAC-seq，并用單細(xì)胞染色質(zhì)可及性注釋細(xì)胞類(lèi)型（圖 2-1h）。在每個(gè)細(xì)胞的線粒體基因組平均覆蓋度為 20-40× 的情況下，作者識(shí)別出 mtDNA 突變，并對(duì)兩個(gè)樣本進(jìn)行了 SSV 分析（圖 2-1i）。老年供體中識(shí)別出的 SSVs 的平均 LIS 高于年輕供體。作者還發(fā)現(xiàn)，來(lái)自老年供體 1 的 11 個(gè) mtDNA 變體中，有 5 個(gè)可被選為優(yōu)質(zhì) SSVs（LIS≥0.6，標(biāo)為紅色）。有趣的是，與低 LIS 的 SSVs 相比，可靠的 SSVs 表現(xiàn)出偏向性的細(xì)胞類(lèi)型組成。例如，9077T>C 定義的細(xì)胞亞群中，CD8+T 記憶細(xì)胞占 89.3%；9223A>G 定義的細(xì)胞亞群中，NK 細(xì)胞占 66.0%（圖 2-1j）。此外，9077T>C 或 9223A>G 亞群內(nèi)的細(xì)胞在染色質(zhì)可及性方面表現(xiàn)出顯著更近的親緣關(guān)系，表明這些 CD8+T 記憶細(xì)胞或 NK 細(xì)胞可能來(lái)自通過(guò)克隆擴(kuò)增產(chǎn)生的共同祖細(xì)胞（圖 2-1k）。對(duì)另一個(gè)獨(dú)立樣本（供體 2）的分析顯示出與供體 1 相似的結(jié)果�？傮w而言，與年輕 PBMC 樣本（圖 2-1d-g）不同，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，在強(qiáng)克隆擴(kuò)增背景下識(shí)別出的 SSVs（尤其是高 LIS 的 SSVs）是有前景的譜系標(biāo)記，進(jìn)一步支持了之前的模擬結(jié)果。

盡管這些結(jié)果與模擬一致，但僅利用染色質(zhì)可及性的相似性來(lái)測(cè)試線粒體譜系追蹤可能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論，因?yàn)樵谀承┣闆r下（如譜系可塑性），染色質(zhì)可及性的相似性與譜系關(guān)系可能不一致。因此，作者利用了另一個(gè) Smart-seq2 數(shù)據(jù)集，其中包括從自身免疫疾病患者中分離的 T 細(xì)胞（圖 2-1l）。我們?cè)俅卫��?T 細(xì)胞受體（TCR）定義的克隆結(jié)構(gòu)，評(píng)估線粒體譜系追蹤在具有顯著克隆擴(kuò)增的免疫反應(yīng)中的效能（圖 2-1m）。作者首先在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者樣本 SLE232 和多發(fā)性硬化癥（MS）患者樣本 MS0816 中進(jìn)行 mtDNA 突變檢測(cè)。在兩個(gè)樣本中識(shí)別出的 SSVs 顯示出多個(gè)高 LIS 的 SSVs，包括 SLE232 中的 3849G>A 和 1201A>G，以及 MS0816 中的 16362T>C（圖 2-1n）。重要的是，通過(guò)比較了 SSVs 定義的亞群與 TCR 序列定義的亞群，發(fā)現(xiàn)這些 SSV 定義的亞群與 TCR 定義的亞群高度一致（圖 2-1n-o）表明這些高 LIS 的 SSVs 可用于識(shí)別真實(shí)克隆。值得注意的是，只有這三個(gè) SSVs（3849G>A、1201A>G 和 16362T>C）表現(xiàn)出低 TCR 多樣性（通過(guò)歸一化香農(nóng)熵 NSE 量化），這再次表明高 LIS 的 SSVs 可作為可靠的譜系標(biāo)記。結(jié)合模擬實(shí)驗(yàn)和多個(gè)單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)集，證明了 LIS 可作為在單細(xì)胞水平識(shí)別真正具有譜系信息的 mtDNA 變體的可靠指標(biāo)。

圖2-1 譜系信息評(píng)分（LIS）可準(zhǔn)確評(píng)估亞群特異性變體（SSVs）的譜系追蹤能力

好了，今天單細(xì)胞譜系追蹤的研究就介紹到這里啦，基于上述的介紹，可以看到單細(xì)胞譜系示蹤分析在研究單細(xì)胞發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)或疾病過(guò)程中如何分化、遷移和轉(zhuǎn)變命運(yùn)都非常有應(yīng)用潛力。樂(lè)備實(shí)作為蛋白檢測(cè)服務(wù)專(zhuān)家，提供了一站式的實(shí)驗(yàn)流程，在實(shí)驗(yàn)和軟件方法開(kāi)發(fā)中都有豐富的經(jīng)驗(yàn)。歡迎各位老師同學(xué)與我們聯(lián)系合作。