用于小鼠前肢亞神經(jīng)分辨率長期功能評估的無線光遺傳刺激系統(tǒng)開發(fā)研究

2025年9月30日，復(fù)旦大學(xué)靜安區(qū)中心醫(yī)院周明杰及其團(tuán)隊(duì)在Nature communications上發(fā)表了名為“A wireless optogenetic stimulation system for long-term function evaluation of mice forelimb with sub-nerve resolution”的文章，文章內(nèi)容表明其開發(fā)了一款植入式光遺傳學(xué)刺激系統(tǒng)，用于解決周圍神經(jīng)轉(zhuǎn)移術(shù)后恢復(fù)評估的問題。

介紹
周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷會(huì)致四肢感覺運(yùn)動(dòng)缺陷，周圍神經(jīng)轉(zhuǎn)移是有效治療手段，已用于臨床及擴(kuò)展到中樞神經(jīng)損傷（如團(tuán)隊(duì)提出的 CC7 手術(shù)、多手術(shù)組合改善脊髓損傷患者上肢功能），但作用機(jī)制不明，且需亞神經(jīng)分辨率的長期刺激平臺(tái)追蹤神經(jīng)肌肉功能變化；因周圍神經(jīng)（尤其高水平神經(jīng)）由支配不同肌群的神經(jīng)束組成，光遺傳學(xué)因時(shí)空精度高適合實(shí)現(xiàn)亞神經(jīng)分辨率調(diào)控，還具臨床轉(zhuǎn)化潛力，然而小動(dòng)物長期可靠的光遺傳學(xué)設(shè)備少，且神經(jīng)再生康復(fù)周期長對設(shè)備壽命要求高；為此研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了完全植入的多位點(diǎn)光遺傳學(xué)刺激系統(tǒng)（FIMOSS），它基于此前的 MOSD 改進(jìn)，集成無線技術(shù)、植入小鼠胸部，能無線供電控制、保持穩(wěn)定性能至少 12 周且具備亞神經(jīng)分辨率，在 Thy1-ChR2-EYFP 小鼠中成功誘導(dǎo)前肢運(yùn)動(dòng)，還闡述了 TBI 和 CC7 術(shù)后神經(jīng)功能重組模式，該系統(tǒng)可作為研究神經(jīng)損傷或術(shù)后功能的有效工具，且有多位點(diǎn)刺激和肢體運(yùn)動(dòng)控制潛力。

結(jié)果
01、FIMOSS 的設(shè)計(jì)和表征
FIMOSS 含植入物與外部設(shè)備，植入物的 MOSD II 可靈活包裹神經(jīng)，不同 μLED 能多角度激活神經(jīng)束實(shí)現(xiàn)亞神經(jīng)分辨率，且完全可植入、小型化無電池，為臂叢神經(jīng)提供四通道可編程無線光遺傳刺激。系統(tǒng)以 2MHz 諧振頻率供電，可無線傳輸刺激命令，用戶術(shù)后仍能更新參數(shù)。植入物僅重 0.127±0.005g（占小鼠體重約 0.5%），不影響其自然行為，還依托商用 PCBA 生產(chǎn)線制造，能低成本批量生產(chǎn)。

圖1：用于周圍神經(jīng)叢長期功能評估的FIMOSS示意圖

02、FIMOSS的電子設(shè)計(jì)
FIMOSS 植入物形似人工耳蝸但尺寸更小，有 4.5mm×4.0mm 正方形驅(qū)動(dòng)區(qū)域（連直徑 5.0mm 圓），0.64mm 長互連可延伸至臂叢神經(jīng)；天線與驅(qū)動(dòng)器 FPC 共面以優(yōu)化厚度，皮下可容納。驅(qū)動(dòng)區(qū)域電路板厚 0.29mm（帶元件 1.2mm），封裝后總厚 2.2mm；互連及神經(jīng)袖帶厚 0.065mm，PDMS 封裝后增至 0.365mm。驅(qū)動(dòng)區(qū)域是含印刷天線的 6 層 FPC 板，搭載 MCU 等元件，F(xiàn)PC 第 4 層延伸為帶 4 個(gè) μLED 的 MOSD II 以對接神經(jīng)。為低成本商用生產(chǎn)，F(xiàn)PC 布局有最小走線寬 / 間隙要求，用特定通孔；選倒裝芯片封裝 μLED（主波長 465nm），其焊盤更穩(wěn)固，提升植入物可靠性與可制造性。
 

圖2：用于長期多位點(diǎn)光遺傳學(xué)刺激的FIMOSS植入物的設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)

03、FIMOSS的力學(xué)特性和封裝
FIMOSS 植入物驅(qū)動(dòng)區(qū)域先涂 12μm 聚對二甲苯 C（生物相容性好、水允許性低），再用 PDMS 封裝；互連與 MOSD II 涂 150μm PDMS，可保護(hù)設(shè)備、保靈活性、緩沖神經(jīng)，經(jīng)加速老化驗(yàn)證能維持 3 個(gè)月體內(nèi)功能。MOSD II 因臂叢神經(jīng)解剖復(fù)雜，互連用直線形（蛇形難適配），到神經(jīng)后呈 L 形轉(zhuǎn)彎，末端 FPC 卷曲為袖帶；其 FPC 厚 65μm、寬 0.79mm，μLED 尺寸 152μm×406μm、厚 100μm，相鄰間距 400μm（適配 250-600μm 神經(jīng)直徑），每側(cè) 4 個(gè) 0.1mm 縫合孔眼（可調(diào)貼合度、輔助預(yù)卷曲，兼顧制造與縫合）。

04、FIMOSS 的無線特性
FIMOSS 植入物無線供電靠外部與植入天線 2MHz 諧振感應(yīng)耦合實(shí)現(xiàn)，接收天線為 6 層印刷銅跡線（電感約 10μH），與電容組成 2.04MHz 諧振器，印刷天線易制造、一致性高且熱安全。系統(tǒng)單向無線通信中，外部設(shè)備以 1.2kHz 編碼消息，植入物解碼后，MCU 的 USART_RX 端口以 1200 波特率接收參數(shù)。負(fù)載掃描顯示，外部設(shè)備 3.3V、60-80mA（天線間距 1mm）時(shí)，負(fù)載≤4mA 植入物可維持 3V 輸出，且植入物 3V 下電流消耗 0.6-2.6mA，默認(rèn)無線條件能滿足功率需求。

圖3：FIMOSS植入物的表征

05、FIMOSS的外部設(shè)備和嵌入式軟件
FIMOSS 外部設(shè)備含 PCBA 系統(tǒng)、銅線天線及 3D 外殼，為手持式掃描儀，可驗(yàn)證 MOSD II 定位及術(shù)后刺激；以 ATMEGA328PB-MU 為 MCU，通過 Arduino IDE 開發(fā)，有兩種模式：模式 1 用 3.3V 電源，MCU 發(fā) PWM 信號(hào)驅(qū)動(dòng)線圈發(fā)射射頻波供電；模式 2 連 PC 接收命令，以調(diào)幅射頻信號(hào)傳至植入物。植入物 MCU 接收解碼信號(hào)，轉(zhuǎn)刺激策略寫入 EEPROM 實(shí)現(xiàn)更新，可靈活調(diào)整 LED_ID、脈沖寬度、脈沖間間隔三個(gè)參數(shù)。

06、FIMOSS體外加速老化試驗(yàn)
為評估 FIMOSS 植入物的長期可靠性，研究人員將 10 個(gè)合格植入物浸入 60°C 鹽水進(jìn)行體外加速老化測試（模擬 12 周體內(nèi)使用），每日測試記錄。結(jié)果顯示，10 個(gè)植入物在 19 天測試期內(nèi)均正常工作，所有 μLED、狀態(tài) LED 正常亮起，且保留重編程能力。根據(jù)加速老化公式，60°C 鹽水環(huán)境下老化速度約為正常情況的 4.92 倍，因此 19 天加速測試相當(dāng)于體內(nèi)至少 93 天（約 13 周）的使用，證明封裝能有效防水以支持長期使用，預(yù)計(jì)植入物可滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需的 12 周體內(nèi)連續(xù)運(yùn)行需求。

07、FIMOSS植入物的熱學(xué)特性
為保障 FIMOSS 植入物光刺激有效且熱安全，研究發(fā)現(xiàn)外部設(shè)備 3.3V（60-80mA）驅(qū)動(dòng)時(shí)，植入物體外溫升至 32°C 穩(wěn)定、體內(nèi) 3600 秒溫升≤1°C，電壓升高則溫升顯著，故體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選 3.3V；用熱敏電阻測 μLED 溫度，極端 2.1mA 照明下溫升至 37°C 穩(wěn)定，實(shí)際實(shí)驗(yàn)用 2.0mA、~1% 占空比刺激，且無神經(jīng)熱損傷，證明熱安全。光電流電壓掃描顯示，160Ω 電阻將 μLED 電流限制在 2.0mA，輸出光功率 2.5mW。3D 有限元分析模擬光輻照度，單個(gè) μLED（2.5mW）激活時(shí)，正對扇區(qū)與遠(yuǎn)扇區(qū)（相距～300μm）輻照度差異大，空間分辨率約 300μm，光功率增加會(huì)增多非特異性刺激；同時(shí)用兩個(gè)相鄰 μLED（2.0mW）照射，可解決角落扇區(qū)盲點(diǎn)，確保神經(jīng)各部分可被光遺傳激活進(jìn)入。
 

圖4：12周后臂叢神經(jīng)長期FIMOSS植入的生物相容

08、FIMOSS的時(shí)間特征
為滿足不同實(shí)驗(yàn)需求，F(xiàn)IMOSS 植入物設(shè)計(jì)了含 μLED 選擇、脈沖寬度、脈沖間間隔的可重新編程刺激參數(shù)，研究人員通過測試 6 組參數(shù)（5 組常用、1 組長時(shí)）驗(yàn)證時(shí)間控制精度。結(jié)果顯示，4 個(gè) μLED 的脈沖寬度偏差約 0.1-0.15ms（偏差率 < 0.4%），脈沖間間隔（1000/2000ms）偏差約 0.5-1ms（偏差率≈0.1%），2 分鐘檢測內(nèi)精度無變化且 μLED 間無差異，證明其能提供高精度光遺傳學(xué)刺激，支持周圍神經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

09、FIMOSS長期植入小鼠臂叢神經(jīng)的生物相容性
為驗(yàn)證 FIMOSS 的生物相容性，研究人員將其植入小鼠臂叢神經(jīng)，12 周后分對照組與上 / 中 / 下軀干植入組測試：運(yùn)動(dòng)分析顯示兩組小鼠前肢多關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)范圍無顯著差異，走道步態(tài)分析的步幅、打印面積等指標(biāo)也無差異，說明運(yùn)動(dòng)功能未受影響；術(shù)后觀察到植入物被薄結(jié)締組織包裹，PDMS 封裝完好，神經(jīng)無炎癥或感染，去除植入物后神經(jīng)連續(xù)性正常；免疫熒光染色顯示植入部位髓鞘分布有序、厚度與對照組無差異，僅見少量炎癥細(xì)胞，綜上表明 FIMOSS 生物相容性良好，不影響小鼠活動(dòng)與神經(jīng)功能。

10、FIMOSS 誘導(dǎo)的明顯前肢運(yùn)動(dòng)
小鼠脊神經(jīng)形成周圍神經(jīng)叢，臂叢神經(jīng)負(fù)責(zé)前肢感覺運(yùn)動(dòng)，故用 FIMOSS 研究；實(shí)驗(yàn)選術(shù)后 12 周切口愈合、異氟醚麻醉的 Thy1-ChR2-EYFP 小鼠，分三組將 MOSD II 接臂叢不同軀干，開不同 μLED 記錄 CMAP 并分析前肢運(yùn)動(dòng)。測試得 20ms 脈寬為合適參數(shù)，上、中、下軀干刺激時(shí)，不同 μLED 對應(yīng)不同運(yùn)動(dòng)及 CMAP 表現(xiàn)。對比光遺傳學(xué)刺激（20ms 脈寬）與電刺激（0.2ms 脈寬、0.5mA），前者空間分辨率更高，可選擇性激活前肢遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)。綜上，F(xiàn)IMOSS 的 4 個(gè) μLED 能高選擇性激活神經(jīng)束誘導(dǎo)不同運(yùn)動(dòng)，空間選擇性優(yōu)于電刺激，還可按臂叢神經(jīng)解剖特征微調(diào)。
 

圖5：FIMOSS在臂叢神經(jīng)上的應(yīng)用，誘導(dǎo)小鼠前肢的明顯運(yùn)動(dòng)

11、FIMOSS 誘導(dǎo)的明顯肌肉收縮
為測試 FIMOSS 對臂叢神經(jīng)的光遺傳刺激能否誘導(dǎo)前肢肌肉收縮，研究以臂叢下軀干為代表做等長肌肉張力實(shí)驗(yàn)：先明確下軀干不同 μLED 與肌肉群對應(yīng)關(guān)系，再切斷肌肉肌腱連力傳感器，用不同 μLED 誘導(dǎo)對應(yīng)肌肉抽搐收縮且抽搐力不同；后用 20-60Hz 光刺激 4 只小鼠，3 秒內(nèi)誘導(dǎo)強(qiáng)直收縮，肱三頭肌歸一化穩(wěn)態(tài)力較高，頻率超 40Hz 該力明顯減小。綜上，F(xiàn)IMOSS 可誘導(dǎo)前肢不同肌肉抽搐或強(qiáng)直收縮，各肌肉收縮相關(guān)指標(biāo)有差異，頻率超 40Hz 力下降與 ChR2 脫敏有關(guān)，與此前研究一致。

12、CC7轉(zhuǎn)移后FIMOSS刺激評估臂叢神經(jīng)電生理變化
已有研究證明 CC7 轉(zhuǎn)移能改善 TBI 后小鼠患側(cè)前肢功能（與脊髓對側(cè)皮質(zhì)脊髓束纖維發(fā)芽有關(guān)），但臂叢神經(jīng)不同神經(jīng)干對功能恢復(fù)的貢獻(xiàn)未知，故利用 FIMOSS 的空間選擇性光遺傳學(xué)刺激，探索 CC7 轉(zhuǎn)移 / 假手術(shù)后 4、8、12 周臂叢神經(jīng)干不同神經(jīng)束的功能變化：轉(zhuǎn)移的中干（C7 神經(jīng)）所支配肌肉的 CMAP 面積術(shù)后 4-12 周逐漸增加，部分肌肉 CMAP 在 12 周有明顯改善，且其對腕部和手部肌肉神經(jīng)支配作用更重要；上、下軀干的 CMAP 面積也呈增長趨勢（尤其 8-12 周），上軀干傾向支配肱三頭肌，上下軀干共同補(bǔ)償負(fù)責(zé)腕手運(yùn)動(dòng)的前臂肌肉神經(jīng)支配。熱圖及加權(quán)分析也顯示上、下軀干對前肢肌肉的功能代償，最終 TBI+CC7 組 12 周后 CMAP 結(jié)果顯著優(yōu)于 TBI 組，這與臂叢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能重組相關(guān)。
 

圖6：多位點(diǎn)光遺傳學(xué)刺激法評估CC7轉(zhuǎn)移后臂叢神經(jīng)的電生理變化模式

13、CC7 轉(zhuǎn)移后 FIMOSS 刺激引起的不同運(yùn)動(dòng)的變化
為研究 CC7 術(shù)后轉(zhuǎn)移 C7 神經(jīng)再支配及上下軀干神經(jīng)支配變化，用 FIMOSS 檢測臂叢神經(jīng) 12 周：再生 C7 神經(jīng)術(shù)后 4-12 周誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)增多、角度增大，8 周后 TBI+CC7 組腕部屈曲更頻繁，12 周可誘導(dǎo)多運(yùn)動(dòng)但角度小于上下軀干；上下軀干運(yùn)動(dòng)角度漸恢復(fù)（尤其 8-12 周），非主要控制運(yùn)動(dòng)角度也增加，TBI+CC7 組下軀干尺神經(jīng)誘導(dǎo)的手指外展更易出現(xiàn)。結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)移 C7 神經(jīng)再支配受影響肌肉，上下軀干功能改善并補(bǔ)償，體現(xiàn)臂叢神經(jīng)功能重組。

圖7：CC7轉(zhuǎn)移后受損前肢的誘導(dǎo)行為變化

討論及未來展望
近年有多種先進(jìn)光遺傳學(xué)設(shè)備，具備完全植入、可吸收等特點(diǎn)，部分可用于自由移動(dòng)動(dòng)物；FIMOSS 未來或兼容市售射頻驅(qū)動(dòng)器以實(shí)現(xiàn)自由移動(dòng)下無線操作，還可通過增加接收線圈匝數(shù)或面積提升能量收集能力。此研究將 MOSD 升級(jí)為 FIMOSS，實(shí)現(xiàn)小鼠電生理和誘導(dǎo)行為實(shí)驗(yàn)的長期隨訪，避免重復(fù)手術(shù)損傷神經(jīng)，能檢測神經(jīng)功能細(xì)微變化且有亞神經(jīng)分辨率，還針對標(biāo)準(zhǔn)化批量生產(chǎn)優(yōu)化，MOSD II 結(jié)構(gòu)降低神經(jīng)受壓風(fēng)險(xiǎn)。相比常用的大鼠坐骨神經(jīng)光遺傳裝置，F(xiàn)IMOSS 適合小鼠臂叢神經(jīng)（深層且解剖復(fù)雜，重復(fù)手術(shù)易致?lián)p傷），可多時(shí)間點(diǎn)評估其功能變化。實(shí)驗(yàn)表明 FIMOSS 能誘導(dǎo)臂叢神經(jīng)多種運(yùn)動(dòng)，動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)束功能恢復(fù)，彌合特異性 - 侵入性差距，保留生理募集模式，且臂叢神經(jīng)調(diào)控或比硬膜外電刺激更安全，還可通過不同刺激參數(shù)實(shí)現(xiàn)不同肌肉收縮效果。FIMOSS 基于 FPC 技術(shù)，雖能保證小型化和靈活性，但柔韌性不及水凝膠等材料，未來可考慮用更先進(jìn)材料優(yōu)化，以拓展應(yīng)用場景。

參考文獻(xiàn)：Zhou M, Yan B, Yang F, Chen C, Wang F, Xu C, Jiang T, Li K, Xie Y, Zheng H, Wang C, Zhang J, Jiang S. A wireless optogenetic stimulation system for long-term function evaluation of mice forelimb with sub-nerve resolution. Nat Commun. 2025 Sep 30;16(1):8702. doi: 10.1038/s41467-025-63746-yIF: 15.7 Q1 . PMID: 41027946; PMCID: PMC12484816

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