Pipetty電動(dòng)移液器在狂犬病毒檢測（巢式RT-PCR）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案采用巢式逆轉(zhuǎn)錄 PCR（巢式 RT-PCR）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)狂犬病毒的高敏感、高特異檢測。適用于人類生前篩查（唾液、腦脊液等）及死后確診（腦組織），亦用于動(dòng)物狂犬病溯源。結(jié)合 Pipetty 電動(dòng)移液器操作，其精準(zhǔn)的移液精度可減少 RNA 提取及 PCR 體系配制中的人為誤差，穩(wěn)定的移液速度避免樣本飛濺導(dǎo)致的交叉污染，提升批量樣本處理的一致性與效率。該方案結(jié)合電動(dòng)移液器優(yōu)勢，可高效支持狂犬病確診、動(dòng)物溯源，為防控提供可靠依據(jù)。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       狂犬病毒為單鏈負(fù)鏈 RNA 病毒，無法直接用常規(guī) PCR 擴(kuò)增，故采用巢式 RT-PCR 檢測，核心是 “逆轉(zhuǎn)錄 + 兩輪遞進(jìn)擴(kuò)增”。首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒 RNA 轉(zhuǎn)化為可擴(kuò)增的 cDNA；接著第一輪 PCR 用外引物（針對(duì)病毒保守基因如 N 基因）擴(kuò)增 cDNA，得到初步產(chǎn)物；再取少量首輪產(chǎn)物，用結(jié)合于首輪產(chǎn)物內(nèi)部的內(nèi)引物進(jìn)行第二輪 PCR。兩輪擴(kuò)增使目標(biāo)片段放大 10⁴-10⁶倍，大幅提升敏感性（可檢出低至 10 拷貝 /mL 的病毒 RNA），且內(nèi)引物僅擴(kuò)特異片段，徹底排除非特異擴(kuò)增，顯著提高檢測特異性，適配生前低載量樣本（如唾液）及死后樣本的狂犬病毒檢測。
 
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)；
④ PCR 儀；
⑤ 水平電泳儀；
⑥ 凝膠成像儀；
⑦ 組織勻漿器等。
 
2、試劑和材料
① 狂大病病毒陽性對(duì)照腦組織；
② 狂大病病毒陰性對(duì)照腦組織；
③  特異性擴(kuò)增引物：
外套上游引物F1:5-GTGTAACACCTCTACAATGG；
外套下游引物R1:5-ACAGTCTCYTCNGCCATCT；
內(nèi)套上游引物F2:5-CAAGATGTGYGCYAAYTGGAG；
內(nèi)套下游引物R2:5-AGCCCTGGTTCGAACATTCT。
④ RNA 提取試劑盒或試劑(商品化試劑)；
⑤ 一步法 RT-PCR 試劑盒或相應(yīng)酶類及緩沖液(商品化試劑),包括反轉(zhuǎn)錄酶、DNA 聚合酶dNTP、反應(yīng)緩沖液、無 RNA 酶水等；
⑥ PCR試劑盒或相應(yīng)酶類及緩沖液(商品化試劑),包括 DNA 聚合酶、dNTP、反應(yīng)緩沖液、無RNA 酶水等；
⑦ TAE 電泳及制膠緩沖液。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、分別從不同部位待檢腦組織(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g，樣品量少時(shí)可取全部組織。剪碎混勻,取其中約1g置組織勻漿器中,加入1mL生理鹽水進(jìn)行勻漿,以3000g離心2min 后取 100μL,勻漿上清于 1.5 mL滅菌離心管中。使用Pipetty電動(dòng)移液器，狂犬病病毒陽性和陰性對(duì)照腦組織各取 100μL分別置于 1.5 mL 滅菌離心管中。唾液樣品直接取 100μL, 置于 1.5 mL滅菌離心管中。
 
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器，使用 RNA 提取試劑盒,按試劑盒說明書提取待檢樣品和對(duì)照樣品總 RNA。
3、用無 RNA 酶水將引物溶解或稀釋至濃度 10 μmol/L。
4、PCR 擴(kuò)增
a）外套擴(kuò)增：使用一步法 RT-PCR 試劑盒,按說明書配制反應(yīng)體系,進(jìn)行擴(kuò)增條件設(shè)置。50 ℃反轉(zhuǎn)錄 30 min;95 ℃預(yù)變性 2 min; 95 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 90 s,30 個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸 5 min。
b)內(nèi)套擴(kuò)增：使用 PCR 試劑盒,以外套擴(kuò)增產(chǎn)物1μL為模板,使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，按說明書配制反應(yīng)體系,進(jìn)行擴(kuò)增條件設(shè)置。95 ℃預(yù)變性2min；95 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30s,72 ℃延伸 30 s,30 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。
 
c) 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：取內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL~10 μL,加樣于含核酸染色劑的 1.0%瓊脂糖凝膠孔中,另孔加5 μL DNA Marker,以 100 V~120 V電壓于 1×TAE 電泳緩沖液中電泳約20 min,于凝膠成像儀內(nèi)觀察結(jié)果。
 
 
四、結(jié)果判定
1、狂犬病病毒陽性對(duì)照樣品出現(xiàn) 255 bp 擴(kuò)增條帶、陰性對(duì)照樣品無特異擴(kuò)增條帶時(shí),檢測結(jié)果成立。
2、被檢樣品出現(xiàn) 255 bp擴(kuò)增條帶時(shí)判定為狂犬病病毒核酸陽性,否則判定為陰性。