Pipetty電動(dòng)移液器在犬細(xì)小病毒檢測(cè)（PCR實(shí)驗(yàn)）中的應(yīng)用

方案摘要：PCR 檢測(cè)是犬細(xì)小病毒診斷的 “金標(biāo)準(zhǔn)”，其高敏感性、高特異性可實(shí)現(xiàn)早期精準(zhǔn)診斷。在實(shí)際應(yīng)用中，需嚴(yán)格把控樣本采集、處理及污染控制環(huán)節(jié)，并結(jié)合狗狗的年齡、臨床癥狀（如體溫、糞便性狀）綜合判斷，才能為治療方案制定（如補(bǔ)液、抗病毒、對(duì)癥支持）提供可靠依據(jù)，降低 CPV 的死亡率。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室移液操作中，人工移液存在精度波動(dòng)大、批量處理效率低、交叉污染風(fēng)險(xiǎn)高的痛點(diǎn)，尤其在犬細(xì)小病毒 PCR 檢測(cè)等對(duì)移液精準(zhǔn)度要求嚴(yán)苛的場(chǎng)景中，人工操作易因誤差導(dǎo)致試劑浪費(fèi)、檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性差，甚至因污染引發(fā)假陽性 / 假陰性，影響診斷準(zhǔn)確性。使用 Pipetty電動(dòng)移液器，可針對(duì)性解決上述問題，提升移液環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)化與可靠性。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      犬細(xì)小病毒（CPV）PCR 檢測(cè)以病毒VP2 基因?yàn)楹诵陌悬c(diǎn)（該基因高度保守、無交叉同源性，確保特異性），通過體外三步溫度循環(huán)實(shí)現(xiàn) CPV DNA 指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。首先 90-95℃變性，使 CPV 雙鏈 DNA 解旋為單鏈；隨后 50-65℃退火，讓特異性引物結(jié)合單鏈 VP2 基因靶點(diǎn)；再于 72℃延伸，Taq 酶以 dNTP 為原料合成新鏈，每輪循環(huán)使病毒 DNA 量翻倍，30-40 輪后可擴(kuò)增至可檢出水平，普通PCR通過瓊脂糖凝膠電泳觀察特定條帶判讀。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② 冰箱(4℃、-20℃、-70℃)；
③ PCR 儀；
④ 高速冷凍離心機(jī)(4℃、離心速度12000r/min以上)；
⑤ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像系統(tǒng)；
⑦ 無DNA酶離心管與帶濾芯吸頭。
 
2、試劑和材料
① DNA isoReagent 試劑:DNA提取試劑，也可用商品化DNA提取試劑盒，或其他等效 DNA 提取試劑和方法，如自動(dòng)化核酸提取儀和其他配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸提��；
② 無水乙醇；
③ DEPC水(0.1%)；
④ PCR相關(guān)試劑:可選擇商品化試劑盒，操作步驟按照說明書進(jìn)行；
⑤ Taq酶及10倍Taq酶反應(yīng)緩沖液:Taq酶濃度為5U/μL，-20℃保存；
⑥ dNTP:含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10 mmol/L，-20 ℃保存；
⑦ 5×TBE電泳緩沖液。
⑧ 引物濃度:20 mol/,其序列如下：
上游引物(CPVF):5'GAA TCT GCT ACT CAG CCA CCA AC-3'；
下游引物(CPVR):5'GTG CAC TAT AAC CAA CCT CAG C-3'；
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、用DEPC水作為CPV陰性對(duì)照，用CPV的細(xì)胞培養(yǎng)物作為CPV陽性對(duì)照，無酶水作為空白對(duì)照。
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器，取處理好的待檢樣品上清液500μL置于1.5mL無DNA酶離心管中，加入500μL DNAiso Reagent 試劑，顛倒混勻6次~8次，靜置約10 min后，12 000 r/min 離心 10 min。
 
3、取上清液(至少500 μL)至新的 1.5 ml無 DNA酶離心管中，每管加入 400 μL無水乙醇，顛倒混勻6次~8次，4000r/min離心2min。
4、 小心棄掉上清液，加1mL 75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，顛倒混勻6次~8次，12000 r/min離心5 min。
5、小心棄掉上清液，倒置在干凈的吸水紙上晾干水分，加入20μL DEPC水溶解DNA沉淀。-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br /> 注：可以使用等效的商品化試劑盒進(jìn)行DNA提取。
6、使用Pipetty電動(dòng)移液器，根據(jù)表1的PCR反應(yīng)體系，設(shè)置單次分液模式，將除DNA模板之外的試劑按照所需孔數(shù)計(jì)算體積并×10%，移取至1.5ML離心管中，混勻模式，自動(dòng)混勻。 
7、設(shè)置連續(xù)分液模式，將混合好的試劑和DNA模板分別加入到96孔板中，離心。 
8、將 PCR管置 PCR儀上按如下程序擴(kuò)增:94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，55 ℃退火 30s，72 ℃延伸40s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min。
9、用TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖平板，將凝膠平板放入水平電泳槽中，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，使用Pipetty，將10μL PCR產(chǎn)物和2μL加樣緩沖液(6X)，混勻后加入樣品孔。
10、電泳時(shí)應(yīng)設(shè)立DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。
11、在120V、90mA條件下電泳約30min，電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果
四、結(jié)果判定
1、CPV陽性對(duì)照樣品擴(kuò)增出大小為559bp的核酸片段，且陰性對(duì)照樣品無擴(kuò)增條帶，判定陰、陽性對(duì)照成立；否則試驗(yàn)結(jié)果無效。
2、在陰、陽性對(duì)照成立條件下，若待檢樣品擴(kuò)增出大小為559bp的核酸片段，判為CPV核酸陽性；若待檢樣品無擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增條帶大小不為559bp，判為CPV核酸陰性。