使用chameleon冷凍電鏡樣本制備系統(tǒng)進(jìn)行厭氧蛋白冷凍電鏡制樣新方法

瀏覽次數(shù)：727　發(fā)布日期：2025-9-3　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

背景

固氮酶是生物界唯一能將大氣中氮?dú)猓∟₂）還原為氨（NH₃）的酶，這一過程稱為生物固氮，是地球氮循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。氨是所有生物合成蛋白質(zhì)、核酸等含氮化合物的基礎(chǔ)原料，因此固氮酶對維持生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。

MoFe 蛋白（鉬鐵蛋白）包含兩個復(fù)雜金屬簇：

P-cluster（Fe₈S₇簇）：負(fù)責(zé)電子傳遞；

FeMoCo（鐵鉬輔因子）：直接催化 N₂ 還原。

Fe 蛋白（鐵蛋白）：通過水解 ATP 驅(qū)動電子向 MoFe 蛋白傳遞。

固氮酶的金屬簇（尤其是 FeMoCo）在有氧條件下會迅速氧化分解，導(dǎo)致固氮酶失活。天然界的中有一種蛋白質(zhì)FeSII可以保護(hù)固氮酶免受氧氣損傷，當(dāng)氧氣濃度升高時， FeSII構(gòu)象從 “閉合態(tài)” 轉(zhuǎn)變?yōu)?“開放態(tài)”，暴露疏水表面。這時FeSII 會與 MoFe 蛋白和 Fe 蛋白結(jié)合，形成長絲狀的FeSII - 固氮酶復(fù)合物。這種結(jié)構(gòu)通過物理隔離將 FeMoCo 包裹在內(nèi)部，阻止 O₂接觸活性中心。

圖1：電鏡下長絲狀的FeSII-固氮酶復(fù)合物

挑戰(zhàn)
厭氧蛋白冷凍電鏡載網(wǎng)制備的核心挑戰(zhàn)在于：傳統(tǒng)的冷凍電鏡樣品制備流程包括將蛋白質(zhì)溶液滴在載網(wǎng)上，然后通過濾紙吸干 (blotting) 去除多余液體，最后快速浸入液氮冷卻的液態(tài)乙烷中進(jìn)行玻璃化冷凍，然而對于氧敏感蛋白的研究，濾紙吸干步驟會導(dǎo)致樣品短暫暴露于空氣中，加劇氧敏感蛋白的氧化損傷。此外，吸干過程本身也可能對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成機(jī)械損傷；其次，因所有進(jìn)入?yún)捬跸涞奈锲肪柘冉?jīng)過脫氣循環(huán)，物料轉(zhuǎn)移過程不僅困難且耗時。

結(jié)果
最近來自加州大學(xué)圣地亞哥分校的F. AkifTezcan和Mark A.HerzikJr.團(tuán)隊(duì)利用最新的全自動冷凍電鏡設(shè)備chameleon成功解析了在厭氧條件下的FeSII-固氮酶復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，相關(guān)結(jié)果在Nature 發(fā)表題為“Structural basis for the conformational protection of nitrogenase from O₂” 的文章。

圖2： FeSII-固氮酶復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

方法

在2025年5月，F(xiàn). AkifTezcan和Mark A.HerzikJr.團(tuán)隊(duì)在Nature Communication 發(fā)表題為“Preparation of oxygen - sensitive proteins for high - resolution cryoEM structure determination using blot - free vitrification”文章分享了如何使用chameleon進(jìn)行厭氧蛋白冷凍電鏡制樣的具體方法。

圖3：chameleon制備厭氧蛋白的具體步驟

1．將氧氣敏感蛋白放入到厭氧箱中操作，在樣品管中加入10~15uL蛋白樣品，隨后小心在樣本上方鋪設(shè)約 70 μL 阿爾油（Al’s oil，Hampton Research 品牌），直至油層與樣本管管口齊平，再放入到玻璃錐形底反應(yīng)瓶（Reacti-Vial，Thermo Fisher Scientific 品牌），轉(zhuǎn)運(yùn)至 chameleon 儀器。

圖4：樣本管油相密封樣品避免空氣接觸

2. 載網(wǎng)玻璃化過程中，液態(tài)乙烷溫度維持在 - 173~-175℃，濕度罩相對濕度（RH）維持在 > 75%。每組樣本加載 2~4 張 chameleon 自吸附載網(wǎng)（Quantifoil Active 300 mesh），在 12 mA 電流下進(jìn)行 40~45 秒輝光放電處理。

3. 載網(wǎng)輝光放電完成后，打開反應(yīng)瓶橡膠塞，立即將 chameleon 樣本杯小心裝入儀器；吸取 7 μL 樣本至分配器，確認(rèn)樣本可正常滴加后，再將樣本滴加至載網(wǎng)。若噴樣器吸頭殘留油相（可在chameleon軟件中實(shí)時查看,見圖5），可將噴液壓力（amplitude）提高 2 倍（約 800），嘗試去除吸頭油污；若無效，每次增加 100 amplitude直至觀察到液滴（最大不超過 1200）；若振幅升至 1200 仍有油污殘留，選擇Mini Prime功能，再執(zhí)行Wipe Dispenser”，確保噴頭徹底干凈、無油污殘留；最終將調(diào)整至可噴出4~5滴樣品為佳。

圖5：chameleon噴樣器噴液檢查

4. 確定最佳樣本滴加條件后，以 300~900 ms的 plunge 冷凍時間進(jìn)行快速制樣；從樣本裝入儀器到第一張載網(wǎng)玻璃化的時間控制在 90~120 秒，后續(xù)每張載網(wǎng)需在前一張冷凍后的 60~120 秒內(nèi)完成；篩選與數(shù)據(jù)收集過程中，優(yōu)先選擇第一張載網(wǎng)進(jìn)行操作。

未來
隨著越來越多的科研團(tuán)隊(duì)認(rèn)識并使用 chameleon，不僅在厭氧蛋白冷凍電鏡制備領(lǐng)域，chameleon 已助力科研人員攻克更多關(guān)于各種蛋白冷凍電鏡的科學(xué)難題，2025年上半年已經(jīng)發(fā)表超過10篇文章，為我們揭示更多生命微觀世界的奧秘，推動結(jié)構(gòu)生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)領(lǐng)域邁向新的高度。如果您也在為您的蛋白冷凍電鏡制備而煩惱，不妨試試 chameleon，開啟你的科研新征程！

引用文獻(xiàn)
[1] Narehood, Sarah M. , et al. "Structural basis for the conformational protection of nitrogenase from O2." Nature 637.8047(2025).

[2] Cook, Brian D. , et al. "Preparation of oxygen-sensitive proteins for high-resolution cryoEM structure determination using blot-free vitrification." Nature Communications 16.1(2025).

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