Pipetty電動移液器在豬藍(lán)耳病毒檢測（RT-PCR）中的應(yīng)用

方案摘要：豬繁殖與呼吸綜合征，是由病毒（PRRSV）感染豬引起的一種高度傳染性疫病，臨床表現(xiàn)為母豬繁殖系統(tǒng)障礙，斷奶仔豬消瘦、生長遲緩以及死亡率增加。該病能引起豬體溫升高、呼吸困難，導(dǎo)致豬耳朵發(fā)紺，又稱藍(lán)耳病，針對 PRRSV RT-PCR 檢測中樣本前處理易損失、反應(yīng)體系配制易污染、批量操作效率低等問題，通過 Pipetty 電動移液器的高精度、防污染及自動化功能，實現(xiàn) RNA 回收率提升、交叉污染降低、檢測周期縮短，保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。
 
 
方案詳情：
一、實驗原理
       核心為 “逆轉(zhuǎn)錄 + PCR 擴(kuò)增”：先以逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒 RNA 轉(zhuǎn)為 cDNA（解決 PCR 不能擴(kuò) RNA 的問題），再用 PRRSV 特異性引物和酶，通過循環(huán)讓 cDNA 指數(shù)級復(fù)制，最后憑特異性熒光信號或 DNA 條帶判斷結(jié)果（有則陽性、無則陰性），整體具有高特異、高敏感的特點。
二、‌實驗準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② PCR 儀；
③ 高速臺式冷凍離心機(jī)（4℃，離心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；
⑤ 凝膠成像系統(tǒng)；
⑥ 混勻器；
⑦ 冰箱（2℃~8℃、-20 ℃和-70 ℃）；
⑧ 組織研磨器。
 
2、試劑和材料
① PBS液；
② 商品化的 RNA 提取裂解液；
③ 三氯甲烷；
④ 異丙醇（-20℃預(yù)冷）；
⑤ DEPC 水；
⑥ 75%乙醇；
⑦ M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（10 U/μL）；
⑧ 5XRT 緩沖液；
⑨ RNA 酶抑制劑（40 U/μL）；
⑩ Tag 酶（10 U/L）；
⑪ 10XPCR 緩沖液；
⑫ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑬ 10xMgCl₂（ 25 mmol/L）；
⑭ 甘油或礦物油；
⑮ 引物；
⑯ 5×TBE 電泳緩沖液；
⑰ EB 溶液；
⑱ 電泳上樣緩沖液：100 mL 溶液中含 0.25g溴酚藍(lán)及 40g蔗糖。
 
三、實驗步驟
1、樣本總 RNA 的提取
a） 取滅菌的 1.5 mL離心管，基于樣本數(shù)量進(jìn)行編號。每管加入 600 μL 細(xì)胞裂解液，使用Pipetty電動移液器，設(shè)置連續(xù)分液功能，然后分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照、空白對照（無核酸酶水）各 200μL，每加一份樣本換用一個吸頭，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混勻器上振蕩混勻5 s。于4 ℃經(jīng) 12 000 r/min 離心 15 min。
 
b） 取相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL離心管，加入 500μL異丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中，并顛倒混勻。
c） 于4 ℃經(jīng) 12 000 r/min 離心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體，然后加入600 μL 75%乙醇進(jìn)行洗滌。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水紙上吸干液體。
e） 64 000 r/min 離心 10 s，將管壁上的殘余液體甩至管底部，用微量移液器吸干液體，室溫干燥3 min。
f） 使用Pipetty連續(xù)分液模式，加入 11 μL DEPC水，混勻模式，自動混勻，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心5s，置于冰上備用。提取的 RNA 應(yīng)在 2h內(nèi)進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，否則應(yīng)置于-70 ℃冰箱保存。
 
2、反轉(zhuǎn)錄（RT）
反應(yīng)液總量 20 μL。依次在 RT 反應(yīng)管中加入 RNA 模板和試劑：

• RNA 模板：提取樣本的總 RNA    5 μL
• 下游引物 P2                     1 μL
• 5XRT緩沖液                     4 μL
• 10 mmol/l dNTPs                2 μL
• RNA 酶抑制劑                   1 μL
• M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶                 1 μL
• DEPC水                         6 μL

經(jīng)4 000 r/min 離心 20 s后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RT的反應(yīng)條件：50 ℃，30 min。

1. PCR擴(kuò)增，

• PCR反應(yīng)體系見表1。

 
b） 將表1中的試劑充分混勻，4 000 r/min 離心 30 s。PCR 的反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。
若采用一步法 RT-PCR，則省略反轉(zhuǎn)錄，用提取的 RNA 直接進(jìn)行反應(yīng)。一步法 RT-PCR 反應(yīng)體系見表2。
 
一步法 RT-PCR 的反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄 30 min;94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸 50 s，35 個循環(huán);72 ℃終延伸 10 min。
4、用 TBE 電泳緩沖液配制 1.5%的瓊脂糖（含 0.5 μg/mL EB）凝膠。將凝膠放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面，將6μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和2μL電泳上樣緩沖液混勻后加入樣本孔。電泳時應(yīng)設(shè)立 DNA Marker 對照。按5 V/cm 進(jìn)行電泳 20 min~30min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。
四、結(jié)果判定
1、試驗成立條件：PRRSV-1（歐洲型）陽性對照有大小為 398 bp的特異性擴(kuò)增條帶；PRRSV-2（美洲型）陽性對照有大小為 433 bp的特異性擴(kuò)增條帶;陰性對照和空白對照無任何擴(kuò)增條帶。
2、被檢樣本有大小為 398 bp的特異性擴(kuò)增條帶，且與陽性對照條帶大小相符，則判為 PRRSV-1核酸陽性。
3、被檢樣本有大小為 433 bp的特異性擴(kuò)增條帶，且與陽性對照條帶大小相符，則判為 PRRSV-2核酸陽性。
4、被檢樣本同時有大小為 398 bp和 433 bp的特異性擴(kuò)增條帶，且與陽性對照條帶大小相符，則判為 PRRSV-1 和 PRRSV-2 核酸陽性。
5、被檢樣本無大小為 398 bp 或 433 bp 特異性的擴(kuò)增條帶，則樣本判為 PRRSV 核酸陰性。必要時，可取 RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，并與已公開發(fā)表的 PRRSV 特異性片段序列進(jìn)行同源性比對分析，以確證檢測結(jié)果。