Pipetty電動(dòng)移液器在登革病毒檢測(cè)（組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)）中的應(yīng)用

方案摘要：本方案登革病毒中和試驗(yàn)中應(yīng)用了 Pipetty 電動(dòng)移液器，以實(shí)現(xiàn)對(duì)血清中登革病毒中和抗體的精準(zhǔn)檢測(cè)。試驗(yàn)基于登革病毒與特異性中和抗體結(jié)合后會(huì)失去感染能力的原理，采用組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)法。通過(guò) Pipetty 電動(dòng)移液器的混勻、連續(xù)分液等功能，完成病毒 TCID50 測(cè)定、血清系列稀釋、抗體與病毒混合孵育、接種細(xì)胞培養(yǎng)等步驟，借助觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），按 Reed-Muench 法判定中和抗體滴度，并通過(guò)對(duì)照驗(yàn)證確保試驗(yàn)有效性。該方案利用 Pipetty 電動(dòng)移液器的精準(zhǔn)操作，提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性與效率，為登革病毒感染的診斷及相關(guān)研究提供可靠支持。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       當(dāng)人體感染登革病毒后，血清中可產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，登革病毒與這種特異性抗體作用后，能被特異性地“中和”，抑制登革病毒的復(fù)制與繁殖，使其失去感染能力。中和試驗(yàn)包括動(dòng)物中和試驗(yàn)、組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)和空斑減少中和試驗(yàn)三種，每種中和試驗(yàn)又分為固定病毒稀釋血清法和固定血清稀釋病毒法兩種。動(dòng)物中和試驗(yàn)由于需要特殊的感染動(dòng)物房，一般的實(shí)驗(yàn)室很難做到，所以更多的實(shí)驗(yàn)室采用的是組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)和空斑減少中和試驗(yàn)，其中空斑減少中和試驗(yàn)比組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)更敏感、特異，但由于前者對(duì)操作技術(shù)的要求更高，而且病毒噬斑小，出斑時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)基的要求也高，故一般實(shí)驗(yàn)室多用的是組織培養(yǎng)中和試驗(yàn)。
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 無(wú)菌細(xì)胞吹打管、吸管；
③ 無(wú)菌平底微量 96 孔組織培養(yǎng)板；
④ 無(wú)菌 1.5mL 塑料離心管；
⑤ 冰盒；
⑥ C0₂培養(yǎng)箱；
⑦ 生物安全柜；
⑧ 倒置顯微鏡。
 
2、試劑和材料
① 登革病毒 1~4型標(biāo)準(zhǔn)毒株、C6/36 細(xì)胞、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清;
② Vero 細(xì)胞
③ 細(xì)胞培養(yǎng)液：如含 10% 胎牛血清的 DMEM 或 RPMI-1640；
④ 維持液：含 2% 胎牛血清的培養(yǎng)液；
⑤ 對(duì)照樣本：陰性血清、陽(yáng)性血清。
 
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、病毒 TCID₅₀測(cè)定（提前 1-2 天完成）
a) 使用Pipetty電動(dòng)移液器的混勻模式，將標(biāo)準(zhǔn)病毒株用維持液做 10 倍系列稀釋?zhuān)?0^-1 至 10^-8）；
 
b) 設(shè)置連續(xù)分液模式，在96孔板中每孔加入 100μL 稀釋后的病毒液，每個(gè)稀釋度設(shè) 4 復(fù)孔；
c) 加入預(yù)先鋪好的 Vero 單層細(xì)胞（每孔約 1×10⁴個(gè)細(xì)胞），37℃、5% CO₂培養(yǎng)；
d) 每日觀察 CPE（細(xì)胞變圓、脫落、聚集等），持續(xù) 5-7 天；
e) 按 Reed-Muench 法計(jì)算 TCID₅₀，確定 100 TCID₅₀對(duì)應(yīng)的病毒稀釋倍數(shù)。
2、用維持液對(duì)待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清做 2 倍系列稀釋?zhuān)ㄈ?1:10、1:20、1:40…… 至 1:1280），每稀釋度設(shè) 3-4 復(fù)孔。
3、使用Pipetty電動(dòng)移液器，按1:1的方式，取適量血清和含 100 TCID₅₀的病毒液添加至離心管，充分混勻后，設(shè)置連續(xù)分液模式，在孔板中每孔加入 200μL 的混合液；
4、設(shè)置對(duì)照孔：
a）病毒對(duì)照：100μL 維持液 + 100μL 100 TCID₅₀病毒液；
b）細(xì)胞對(duì)照：100μL 維持液 + 100μL 維持液（無(wú)病毒和血清）；
c）37℃孵育 1 小時(shí)（讓抗體與病毒充分結(jié)合）。
5、接種細(xì)胞并培養(yǎng)
a）棄去 96 孔板中預(yù)先鋪好的 Vero 細(xì)胞的原有培養(yǎng)液；
b）設(shè)置連續(xù)分液模式，在孔板中每孔加入上述中和反應(yīng)后的混合液 100μL，37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
 
c）培養(yǎng) 2-3 天后，若培養(yǎng)液變黃，可半量更換維持液（避免細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不足）。
6、每日用倒置顯微鏡觀察 CPE，記錄各孔是否出現(xiàn) CPE（以 “+” 表示有 CPE，“-” 表示無(wú) CPE），觀察至病毒對(duì)照孔出現(xiàn) 75% 以上 CPE（通常 5-7 天），且細(xì)胞對(duì)照孔無(wú) CPE 時(shí)終止觀察。
四、結(jié)果判定
1、中和抗體滴度定義：能抑制 50% 復(fù)孔出現(xiàn) CPE 的血清最高稀釋度的倒數(shù)。
2、計(jì)算方法：按 Reed-Muench 法，統(tǒng)計(jì)各稀釋度血清中 “無(wú) CPE 孔” 的比例，找到抑制 50% CPE 對(duì)應(yīng)的稀釋度。
3、對(duì)照驗(yàn)證：
a）病毒對(duì)照孔必須出現(xiàn)明顯 CPE；
b）細(xì)胞對(duì)照孔必須無(wú) CPE；
c）陽(yáng)性對(duì)照血清滴度需在預(yù)期范圍，陰性對(duì)照血清應(yīng)無(wú)中和作用（即所有復(fù)孔均出現(xiàn) CPE）。