CRISPR-Pro基因敲除/敲入鼠

與Jackson Lab展示的CRISPR/Cas9基因編輯效率相比，賽業(yè)生物（Cyagen）CRISPR-Pro在敲入片段長(zhǎng)度與敲入效率方面都更具優(yōu)勢(shì)。
 
CRISPR-Pro服務(wù)流程與周期
             
 
 
CRISPR-Pro基因敲除常用大小鼠模型
                 
完全性基因敲除鼠
            
CRISPR-Pro完全性基因敲除鼠是通過(guò)CRISPR /Cas9基因敲除技術(shù)，針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)和構(gòu)建gRNA與Cas9表達(dá)質(zhì)粒，造成目的基因的功能區(qū)域被敲除，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。
              
CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移碼突變、片段基因敲除、雙/多基因敲除。
 
移碼突變鼠的建系原則與流程
                
1、通過(guò)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR和測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F1代雜合子鼠；
 
3、選擇來(lái)自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達(dá)到性成熟后進(jìn)行互配，可獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子，50%為雜合子，25%為野生鼠。
 

 
片段基因敲除鼠的建系原則與流程
              
1、通過(guò)針對(duì)靶基因不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的一對(duì)gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR鑒定陽(yáng)性的F1代雜合子鼠；
 
3、選擇來(lái)自同一只F0代鼠，基因型一致的F1代鼠，達(dá)到性成熟后互配，可獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為純合子，50%為雜合子，25%為野生鼠。
 
 
雙（多）基因敲除鼠的建系原則與流程
              
1、通過(guò)針對(duì)兩個(gè)靶基因分別設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的gRNA質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)錄為RNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代多基因雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR和測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F1代雙基因雜合子鼠；
3、選擇雙基因雜合子鼠進(jìn)行雜交，獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。
 
條件性基因敲除鼠
               
條件性基因敲除是通過(guò)把兩個(gè)LoxP位點(diǎn)插入到目的基因的一個(gè)或幾個(gè)重要外顯子的兩端以制備出有兩個(gè)floxed小鼠。該floxed小鼠在與表達(dá)Cre重組酶小鼠雜交之前，該基因表達(dá)正常；當(dāng)floxed小鼠與組織特異性表達(dá)Cre酶的小鼠進(jìn)行雜交后，可實(shí)現(xiàn)在特定的組織或細(xì)胞中敲除該基因，而在其它組織或細(xì)胞中該基因表達(dá)正常。
 
建系原則與流程：
              
1、與野生型小鼠雜交：陽(yáng)性CRISPR-Pro小鼠（+/flox）與野生型小鼠（+/+）雜交，獲得F1代雜合子小鼠（+/flox）；
2、挑選一對(duì)F1代雜合子小鼠（+/flox）進(jìn)行自交，獲得F2代純合子小鼠（flox/flox）。

 
 
基因敲入鼠
               
CRISPR-Pro基因敲入鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技術(shù)，針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建相應(yīng)的 gRNA質(zhì)粒和donor vector，通過(guò)Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重組，引入特定的突變或外源基因。比如在目的基因上引入點(diǎn)突變(模擬人類遺傳疾病模型)或?qū)��?bào)告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位點(diǎn)，從而可以通過(guò)報(bào)告基因來(lái)跟蹤目標(biāo)基因的表達(dá)；也可以用報(bào)告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同時(shí)發(fā)生。
   
CRISPR-Pro基因敲入鼠包括：點(diǎn)突變、片段基因敲入。
 
點(diǎn)突變鼠的建系原則與流程
                  
1、通過(guò)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建gRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)錄為RNA，再合成含有突變位點(diǎn)信息的donor oligo，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR和測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F1代雜合子鼠；
 
3、  選擇來(lái)自同一只F0代鼠，敲入位點(diǎn)一致的F1代鼠，達(dá)到性成熟后進(jìn)行同胞交配，可獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為敲入位點(diǎn)一致的純合子鼠，有50%為只有一條染色體敲入的雜合子鼠，有25%為野生型鼠。
 
 
片段基因敲入的建系原則與流程
                  
1、通過(guò)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)、構(gòu)建gRNA質(zhì)粒和含有突變位點(diǎn)信息的donor vector，將以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為mRNA后，與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測(cè)序鑒定陽(yáng)性的F0代雜合子鼠；
2、F0代雜合子鼠與野生型鼠進(jìn)行交配，獲得PCR鑒定基因型和測(cè)序鑒定隨機(jī)插入的F1代雜合子鼠；
 
3、  選擇來(lái)自同一只F0代鼠，敲入位點(diǎn)一致的F1代鼠，達(dá)到性成熟后進(jìn)行同胞交配，可獲得F2代鼠。對(duì)獲得的F2代鼠進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定，理論上，F(xiàn)2代鼠中25%為敲入位點(diǎn)一致的純合子鼠，有50%為只有一條染色體敲入的雜合子鼠，有25%為野生型鼠。
 
 
Rosa26定點(diǎn)基因敲入小鼠
                     
指在Rosa26位點(diǎn)插入某種基因的基因敲入小鼠模型（也稱轉(zhuǎn)基因小鼠模型）。Rosa26位點(diǎn)基因敲入小鼠模型不僅插入位點(diǎn)精準(zhǔn)，同時(shí)由于Rosa26是安全區(qū)域，所以外源性的基因定點(diǎn)插入這個(gè)位點(diǎn)不會(huì)影響其他基因的表達(dá)；而且由于是單拷貝基因插入，因此更容易預(yù)測(cè)表達(dá)量；結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，可使外源基因在特定組織及特定時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，可用來(lái)高效構(gòu)建多用途的條件性基因敲入小鼠模型，因此越來(lái)越受到科研人員的青睞。
 
構(gòu)建原理圖：
          
Rosa26位點(diǎn)基因敲入(基于CRISPR-Pro技術(shù)）
               
 
 
Rosa26位點(diǎn)條件性基因敲入(基于CRISPR-Pro技術(shù)）

 
 
構(gòu)建流程：
 
 
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1. 外源基因的重組位置確定，更有利于表達(dá)；
2. 結(jié)合Cre-loxP系統(tǒng)，可以使外源基因在特定組織及特定時(shí)間表達(dá)；
 
H11位點(diǎn)基因敲入小鼠

Rosa26是一個(gè)經(jīng)典的基因插入位點(diǎn)，雖然對(duì)于Rosa26位點(diǎn)的研究較多，但制作多基因插入小鼠時(shí)仍需要其他合適的插入位點(diǎn)。H11（Hipp11）是另一個(gè)可供選擇的插入位點(diǎn)，也是一個(gè)安全區(qū)域，在此位點(diǎn)的插入基因不會(huì)影響其他基因表達(dá)，同時(shí)此插入基因的表達(dá)也不會(huì)受到周邊區(qū)域的影響。
H11位于小鼠 11 號(hào)染色體，是位于Eif4enif1與Drg1兩個(gè)基因之間的一個(gè)位點(diǎn)，于 2010 年由 Hippenmeyer S.發(fā)現(xiàn)，整合到 H11 位點(diǎn)的外源基因可以穩(wěn)定高效的表達(dá)。利用Crispr/Cas9基因編輯技術(shù)，可將外源的基因片段定點(diǎn)插入到小鼠的H11位點(diǎn)。與Rosa26相比，其優(yōu)點(diǎn)是不受旁側(cè)啟動(dòng)子影響，因此更合適用于表達(dá)外源基因。結(jié)合loxp系統(tǒng)，可構(gòu)建組織特異性表達(dá)小鼠模型。
 
構(gòu)建原理圖：

 
 
構(gòu)建流程：

 
 
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1. 穩(wěn)定性高，后代表達(dá)一致；
2. 實(shí)用性強(qiáng)，能實(shí)現(xiàn)A基因在Rosa26位點(diǎn)及B基因在H11位點(diǎn)同時(shí)過(guò)表達(dá)；
3. 經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，F(xiàn)1代即可開始實(shí)驗(yàn)。
 
 

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