Pipetty電動(dòng)移液器在馬流感RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

Pipetty電動(dòng)移液器在馬流感RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用
方案摘要：本方案結(jié)合了Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)控量、連續(xù)移液、操作穩(wěn)定、防交叉污染的核心優(yōu)勢(shì)，規(guī)范樣品處理、RNA提取、反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)，規(guī)避手動(dòng)移液易出現(xiàn)的誤差、效率低下、污染風(fēng)險(xiǎn)等問題，充分發(fā)揮其移液精準(zhǔn)度高、重復(fù)性強(qiáng)、操作便捷的特點(diǎn)，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、一致性和可靠性，為馬流感的快速、精準(zhǔn)檢測(cè)提供標(biāo)準(zhǔn)化操作依據(jù)，適用于動(dòng)物疫病防控機(jī)構(gòu)、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室等開展馬流感核酸檢測(cè)工作，助力提升檢測(cè)工作的效率與質(zhì)量。
 
 
 
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
將馬流感病毒（EIV）感染樣品中的RNA提取后，利用一步法RT-PCR技術(shù)，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，借助特異性引物（HF、HR、MF、MR）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察特異性條帶，根據(jù)條帶大小及有無，判定樣品中是否含有馬流感病毒核酸，實(shí)現(xiàn)對(duì)馬流感的快速檢測(cè)。
 
 
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 低溫臺(tái)式高速離心機(jī)；
③ PCR儀；
④ 電泳儀；
⑤ 水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像系統(tǒng)。
 
2、試劑和材料
① 病毒RNA提取試劑盒；
② 一步法RT-PCR試劑盒；
③ 瓊脂糖；
④ 引物；
⑤ 陽性對(duì)照:EIV雞胚/細(xì)胞培養(yǎng)物、EIV核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品/質(zhì)控品、感染EIV的陽性組織樣品、RT-PCR陽性對(duì)照質(zhì)粒均可作為陽性對(duì)照；
⑥ 陰性對(duì)照(DEPC處理水)；
⑦ 帶有250bp和500bp分子質(zhì)量的DNAMlarker(如:DL2000)。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、將采集的拭子樣品充分捻動(dòng)、擠干后，使用Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-1000移取200μL樣品液，轉(zhuǎn)入無菌離心管中，備用。
2、使用病毒RNA提取試劑盒，按試劑盒說明書步驟提取病毒RNA：借助Pipetty電動(dòng)移液器，精準(zhǔn)移取試劑盒中的裂解液、洗滌液等試劑，加入樣品液中，充分混勻后經(jīng)低溫臺(tái)式高速離心機(jī)離心處理；最后用移液器移取洗脫液，收集提取的病毒RNA。提取的病毒RNA應(yīng)立即進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，若暫不反應(yīng)，需置于-70°C冰箱保存。
3、將RT-PCR試劑盒中的所有試劑置冰上融化，充分混勻后備用；取n+2個(gè)PCR反應(yīng)管（n為待檢樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照·數(shù)總和），將4種引物分別配制成10μmol/L的使用液。在25μL反應(yīng)體系中，每種引物加1μL，按照表1所示比例，使用Pipetty連續(xù)分液模式，精準(zhǔn)移取各試劑組分，依次加入PCR反應(yīng)管中。  
4、將加樣后的PCR反應(yīng)管按順序放入PCR儀中，設(shè)置如下反應(yīng)程序并啟動(dòng)反應(yīng)：42°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預(yù)變性2min，進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；94°C變性30s、53.6°C退火40s、72°C延伸40s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，反應(yīng)結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管。
注：反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，可根據(jù)所使用RT-PCR試劑盒的說明書，適當(dāng)調(diào)整各試劑用量及反應(yīng)溫度和時(shí)間。

1. 配制1.5%瓊脂糖凝膠，待凝膠凝固后，使用Pipetty分別移取5μL PCR產(chǎn)物和5μL DNA Marker，依次加入凝膠加樣孔中，接通電泳儀電源，進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，觀察并記錄擴(kuò)增條帶情況。

 
四、結(jié)果判定
1、結(jié)果成立條件
陽性對(duì)照擴(kuò)增出596bp和224bp大小的兩條片段;陰性對(duì)照沒有特異性片段。
2、陽性
待檢樣品擴(kuò)增出596bp和224 bp大小的兩條片段，判定為H3亞型EIV核酸陽性。
3、陰性
待檢樣品無擴(kuò)增產(chǎn)物，判定為H3亞型EIV核酸陰性。
4、疑似
待檢樣品僅擴(kuò)增出一條224 bp片段判定為疑似EIV核酸陽性。再次RT-PCR檢測(cè)后，如仍為一條224bp片段，則樣品可能含有其他類型流感病毒，應(yīng)進(jìn)行病毒分離鑒定，或重新采樣進(jìn)行檢測(cè)。
待檢樣品僅擴(kuò)增出一條596 bp片段判定為疑似EIV核酸陽性。再次RT-PCR檢測(cè)后,如仍為一條596bp片段，則樣品可能污染，應(yīng)重新采樣進(jìn)行檢測(cè)。