激光共聚焦生物芯片掃描儀解析枯草芽孢桿菌調(diào)控牙周炎炎癥通路的機制

牙周炎是由多種微生物與宿主免疫反應引起的牙周支持組織的慢性炎癥。牙齦上皮細胞借助模式識別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識別包含核心致病菌牙齦卟啉單胞菌等口腔病原體，構成了抵御感染的首要屏障。而最為關鍵的Toll 樣受體（Toll-like receptors, TLRs，TLR4 ）可感知病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），包括脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）和脂蛋白等。TLR4激活后會觸發(fā)下游信號通路（尤其是 NF-κB 通路），促進IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促炎細胞因子的產(chǎn)生。這些細胞因子隨后放大炎癥級聯(lián)反應，加劇牙周組織損傷。

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性桿狀細菌，能形成具有高度抵抗力的芽孢，耐受極端高溫、干燥及其他不利環(huán)境條件，可在胃酸、膽汁豐富的胃腸道以及復雜的口腔微生物生態(tài)系統(tǒng)等惡劣環(huán)境中存活。該菌可通過產(chǎn)生枯草菌素等多種抗菌肽發(fā)揮有益作用，具有抑制牙周致病菌生長的潛力。

在此前小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌 R0179可通過分泌含有中康酸的上清液，抑制牙齦卟啉單胞菌生長及生物膜的形成與成熟，進而抑制該菌誘導的實驗性牙周炎。因此，需要闡明熱滅活枯草芽孢桿菌 R0179 是否通過 TLR 信號通路調(diào)控牙周炎癥，為牙周炎的預防和管理提供理論支持。

文章題目為“Inactivated Bacillus subtilis R0179 Inhibits Porphyromonas GingivalisInduced Gingival Inflammation Via TLR2/NF-κB Signaling in a Murine Model of Periodontitis”于2025年8月發(fā)表在Inflammation雜志，作者來自北京大學口腔預防學系國家口腔臨床研究中心。

研究人員為了評估牙齦卟啉單胞菌穿透牙齦上皮細胞的能力，將該菌與牙齦上皮細胞共培養(yǎng)2小時后收集樣本，進行透射電子顯微鏡觀察。與對照組（C組）相比，牙齦卟啉單胞菌感染組（C+Pg 組）中，牙齦卟啉單胞菌可侵入牙齦上皮細胞的細胞質(zhì)，并被吞噬體包裹形成吞噬小泡（圖1A中箭頭所示）。隨后使用qPCR（定量聚合酶鏈反應）和Western blot（蛋白質(zhì)印跡法）檢測牙齦卟啉單胞菌刺激后牙齦上皮細胞中TLR（Toll 樣受體）的水平變化。

結(jié)果表明，與對照組（MOI=0 的牙齦卟啉單胞菌刺激組）相比，MOI=50 的牙齦卟啉單胞菌可顯著提高細胞中 TLR4 的蛋白和 mRNA水平。以 MOI=50 的牙齦卟啉單胞菌刺激上皮細胞12小時后，發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌刺激可上調(diào) TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 及磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）的表達，并促進促炎細胞因子的釋放。為驗這些變化，研究人員通過細胞因子芯片檢測 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達，使用法國Innopsys激光共聚焦熒光微陣列生物芯片掃描分析儀進行熒光信號檢測及分析。結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌刺激可誘導上皮細胞中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達上調(diào)，該結(jié)果也驗證了qPCR 實驗中觀察到的細胞因子 mRNA 表達趨勢（如圖1）。

 圖 1 牙齦卟啉單胞菌侵入牙齦上皮細胞并激活牙齦上皮細胞中的多種 Toll 樣受體（TLR）及炎癥通路.（A）透射電子顯微鏡圖像顯示，牙齦卟啉單胞菌與牙齦上皮細胞共培養(yǎng) 2 小時后被細胞內(nèi)化的情況。（B）采用 qPCR（定量聚合酶鏈反應）和 Western blot（蛋白質(zhì)印跡法），分析不同感染復數(shù)（MOI）的牙齦卟啉單胞菌刺激牙齦上皮細胞 12 小時后，TLR4 的表達水平。（C）采用 qPCR 和 Western blot，分析感染復數(shù)（MOI）為 50 的牙齦卟啉單胞菌在不同時間點刺激牙齦上皮細胞后，TLR4 的表達水平。（D）Western blot 分析上皮細胞中 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、NF-κB（核因子 κB）及磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）的蛋白表達水平。各組縮寫如下：對照組（C 組）、牙齦卟啉單胞菌刺激組（C+Pg 組）。（E）qPCR 分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、白細胞介素 - 1β（IL-1β）、白細胞介素 - 6（IL-6）及腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）的信使核糖核酸（mRNA）水平。（F）代表性細胞因子芯片膜圖像顯示 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的分泌表達情況。其中，POS-1 和 POS-2 為陽性對照孔。（G）通過熒光強度對細胞因子芯片結(jié)果進行定量分析。統(tǒng)計學差異以平均值 ± 標準差（mean±SD）表示，* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.005，*** 代表 P<0.001。

為探究枯草芽孢桿菌 R0179 是否能逆轉(zhuǎn)牙齦卟啉單胞菌刺激誘導的 TLR、下游 p-NF-κB 及促炎細胞因子表達變化，研究人員通過 Western blot、qPCR 和抗體芯片實驗進行了驗證。與單獨牙齦卟啉單胞菌感染組（Pg組）相比，枯草芽孢桿菌 R0179（MOI=50）共刺激組顯著降低了TLR2、TLR4 及 p-NF-κB 的蛋白水平，但對 TLR1 和 TLR6 的蛋白水平無顯著影響。

qPCR 結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌 R0179 處理可下調(diào)牙齦卟啉單胞菌誘導的TLR2、TLR4、IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的 mRNA 水平，對 TLR1 和 TLR6 的 mRNA 水平無顯著影響。此外，枯草芽孢桿菌 R0179 還能下調(diào)牙齦卟啉單胞菌刺激的牙齦上皮細胞分泌 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的水平。蛋白芯片檢測結(jié)果進一步驗證了 qPCR 實驗中觀察到的細胞因子 mRNA 表達變化趨勢（圖2）。

 圖 2 枯草芽孢桿菌 R0179 減輕牙齦卟啉單胞菌誘導的牙齦上皮細胞中 Toll 樣受體（TLR）/ 磷酸化核因子 κB（p-NF-κB）激活及炎癥反應.（A）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、NF-κB 及 p-NF-κB 的蛋白表達水平。各組縮寫如下：牙齦卟啉單胞菌刺激組（Pg 組）、牙齦卟啉單胞菌 + 枯草芽孢桿菌 R0179 刺激組（Pg+B. subtilis 組）。（B）定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、白細胞介素 - 1β（IL-1β）、白細胞介素 - 6（IL-6）及腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）的信使核糖核酸（mRNA）表達水平。（C）代表性細胞因子芯片圖像顯示 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 的分泌情況。（D）通過熒光強度對細胞因子芯片結(jié)果進行定量分析。統(tǒng)計學差異以平均值 ± 標準差（mean±SD）表示，* 代表 P<0.05，** 代表 P<0.005，*** 代表 P<0.001。

為驗證枯草芽孢桿菌 R0179 在體內(nèi)調(diào)控牙齦卟啉單胞菌誘導炎癥的機制，研究人員開展了體內(nèi)實驗。對上頜組織的蘇木精 - 伊紅（H&E）染色結(jié)果顯示，牙齦卟啉單胞菌刺激會加重牙齦炎癥，而枯草芽孢桿菌 R0179 處理可減輕該菌誘導的牙齦炎癥程度。與對照組（C 組）相比，牙齦卟啉單胞菌刺激組（C+Pg 組）中 TLR2、TLR4、p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達升高；而枯草芽孢桿菌 R0179 處理組（C+Pg+B.subtilis 組）可抑制牙齦卟啉單胞菌誘導的 TLR2、TLR4、p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達。此外，TLR2 受體激動劑處理可拮抗枯草芽孢桿菌 R0179 的作用，提高 p-NF-κB、IL-6、IL-1β 及 TNF-α 的表達，而 TLR4 受體激動劑處理無顯著影響。

本研究探討了枯草芽孢桿菌 R0179 對牙齦卟啉單胞菌誘導炎癥反應的調(diào)控作用，系統(tǒng)評估了牙齦卟啉單胞菌和枯草芽孢桿菌 R0179 處理后，牙齦上皮細胞中 Toll 樣受體（TLRs）、磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）及下游促炎細胞因子表達的變化。研究結(jié)果不僅證實了牙齦卟啉單胞菌在牙周炎發(fā)病過程中誘導牙齦炎癥的作用，還揭示了枯草芽孢桿菌 R0179 可能通過抑制 TLR2/NF-κB 通路，減輕牙齦卟啉單胞菌誘導的炎癥反應。這些發(fā)現(xiàn)揭示，熱滅活枯草芽孢桿菌 R0179 有望成為牙周炎管理中的一種潛在輔助治療手段。

原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s10753-025-02348-8

Innopsys 成立于1999年，總部位于法國圖盧茲，致力于熒光檢測硬件生產(chǎn)和軟件自主開發(fā)。

IS系列激光共聚焦微陣列生物芯片掃描分析儀： 

* 實時激光共聚焦光路和獨立PMT檢測器，靈敏度高；
* 多激光光路同時掃描，掃描速度快；
* 線掃描方式，圖片無拼痕、無需陰影矯正，并有效降低熒光的光漂白現(xiàn)象及信號損失；
* 掃描和分析基因芯片、核酸芯片、 糖芯片、蛋白芯片、反向蛋白芯片、化合物芯片、單細胞WB免疫印跡芯片、覆膜芯片、細胞組織芯片及各種商品化生物芯片；
* 用于蛋白互作分析、細胞信號轉(zhuǎn)導通路研究、疾病標志物篩選、化合物藥物篩選、多重因子檢測，病理組織篩查等研究方向。