全自動(dòng)移液工作站firefly®在高效的靶向測(cè)序中的應(yīng)用

二代測(cè)序（NGS）平臺(tái)正通過(guò)不斷提升通量、降低測(cè)序成本，持續(xù)推動(dòng)技術(shù)革新。這一趨勢(shì)使得大規(guī)�；�因組學(xué)研究中的主要瓶頸已從測(cè)序本身轉(zhuǎn)移至文庫(kù)制備環(huán)節(jié)。尤其是在群體規(guī)�；�因組學(xué)與靶向測(cè)序應(yīng)用中，傳統(tǒng)手工文庫(kù)制備方法仍面臨流程繁瑣、耗時(shí)久、成本高等現(xiàn)實(shí)挑戰(zhàn)。

Twist 公司的FlexPrep™ 超高通量（UHT）文庫(kù)制備與雜交捕獲試劑盒憑借兩項(xiàng)核心創(chuàng)新，能有效應(yīng)對(duì)上述挑戰(zhàn)。首先，Normalization by Ligation™（NBL）技術(shù)消除了在文庫(kù)制備前對(duì)每個(gè)DNA樣本進(jìn)行定量和均一化（normalization）的要求，即能夠?qū)⒉煌�起始量的待測(cè)樣本穩(wěn)定轉(zhuǎn)化為可測(cè)序文庫(kù)；其次，在文庫(kù)構(gòu)建流程的前期便引入分子標(biāo)簽（barcode），使樣本在連接反應(yīng)后即可直接混合（pooling），從而大幅減少后續(xù)的實(shí)驗(yàn)流程步驟和反應(yīng)體系，所需的耗材和試劑用量可節(jié)省高達(dá)12倍。這些創(chuàng)新設(shè)計(jì)使得每個(gè)靶向捕獲反應(yīng)可同時(shí)支持96個(gè)樣品，在顯著降低試劑消耗與人工操作時(shí)間的同時(shí)，充分提升了測(cè)序平臺(tái)的運(yùn)行效率。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了SPT Labtech的全自動(dòng)移液工作站firefly® 來(lái)運(yùn)行Twist FlexPrep UHT文庫(kù)制備與雜交捕獲實(shí)驗(yàn)流程。實(shí)驗(yàn)選用了384個(gè)來(lái)自�；�因組DNA（Sigma Aldrich 36231-M）的樣品，并在384孔板的4個(gè)象限中分別投入了30、60、90和120 ng 4種不同的起始量，以此展現(xiàn)了firefly具有可拓展、無(wú)人值守化以及重復(fù)性高等特點(diǎn)，所得數(shù)據(jù)質(zhì)量經(jīng)驗(yàn)證與成熟的基因組分析方法結(jié)果相當(dāng)。

將Twist FlexPrep超高通量（UHT）文庫(kù)制備試劑盒、SPT Labtech公司的firefly平臺(tái)和Element Biosciences公司的Trinity™ 測(cè)序化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，并運(yùn)用Twist Biosciences公司的�；�因組（Bovine DNA）捕獲Panel實(shí)現(xiàn)了"雜交-測(cè)序同步化"的靶向捕獲和富集。該工作流程為高通量基因組學(xué)研究提供了一個(gè)穩(wěn)定可靠、靈活高效且具有顯著成本優(yōu)勢(shì)的解決方案，能夠在大規(guī)模樣本隊(duì)列研究中對(duì)已知或未知的新型基因進(jìn)行高效檢測(cè)和分析。

圖1. 整合firefly平臺(tái)與Element Trinity™技術(shù)的自動(dòng)化文庫(kù)制備、靶向富集及測(cè)序全流程示意圖

本圖展示了整合SPT Labtech firefly平臺(tái)與Element Biosciences Trinity™測(cè)序儀內(nèi)雜交捕獲及測(cè)序的全流程。gDNA樣本首先通過(guò)firefly平臺(tái)在384孔板上進(jìn)行片段化與連接反應(yīng)，并借助12個(gè)內(nèi)聯(lián)條形碼 （incline barcodes）在建庫(kù)前期即實(shí)現(xiàn)樣本混合。隨后，混合文庫(kù)在32個(gè)孔內(nèi)（384/12=32）中完成連接后的純化、PCR擴(kuò)增及SPRI純化，在維持文庫(kù)質(zhì)量的同時(shí)顯著減少了試劑用量和人工操作時(shí)間。完成質(zhì)控（QC）檢測(cè)后，文庫(kù)進(jìn)入Trinity工作流程，探針雜交捕獲直接在測(cè)序儀內(nèi)的卡盒芯片上進(jìn)行并完成測(cè)序。

FlexPrep™ NBL技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同DNA起始量下穩(wěn)定的文庫(kù)產(chǎn)出


圖2. FlexPrep™ Normalization by Ligation ™ (NBL) 技術(shù)可在寬泛的DNA起始量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的文庫(kù)產(chǎn)出

采用Twist Bioscience FlexPrep™ 超高通量文庫(kù)制備試劑盒，對(duì)30至300 ng起始量范圍內(nèi)的基因組DNA進(jìn)行文庫(kù)normalization性能評(píng)估。圖A：在不同DNA起始量下NGS測(cè)序reads數(shù)保持較高的均一性，從而避免繁瑣的DNA定量步驟。圖B: 在相同的DNA起始量范圍內(nèi)，插入片段大小中位數(shù)（median insert size）保持穩(wěn)定，體現(xiàn)了NBL技術(shù)在實(shí)現(xiàn)文庫(kù)產(chǎn)出均一化的同時(shí)，能夠維持目標(biāo)插入片段大小，并有效規(guī)避基于轉(zhuǎn)座酶方法常見的性能問(wèn)題。

FlexPrep™ UHT文庫(kù)制備工作流程


圖3. 傳統(tǒng)酶切文庫(kù)制備流程與Twist FlexPrep™ UHT超高通量工作流程對(duì)比

傳統(tǒng)酶切文庫(kù)制備流程與Twist FlexPrep™ UHT文庫(kù)制備流程（96樣本）對(duì)比示意圖。傳統(tǒng)流程中，從DNA稀釋定量到片段化、連接、純化、PCR及最終質(zhì)控的每個(gè)步驟均需在獨(dú)立的96孔標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中進(jìn)行。相比之下，F(xiàn)lexPrep™ UHT流程在連接反應(yīng)中引入了barcode，使樣本可在首次SPRI純化前完成混合。通過(guò)在前期將96個(gè)樣品混合至8個(gè)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系，能夠在確保文庫(kù)質(zhì)量與一致性的同時(shí)，顯著減少試劑和耗材的消耗、人工操作時(shí)間及整體實(shí)驗(yàn)成本。

傳統(tǒng)雜交捕獲和Element Trinity™ 機(jī)內(nèi)雜交的流程對(duì)比


圖4. 傳統(tǒng)雜交捕獲流程與Element Trinity™測(cè)序儀內(nèi)雜交工作流程對(duì)比

本示意圖對(duì)比了常規(guī)外顯子組與靶向Panel測(cè)序所用的傳統(tǒng)雜交捕獲流程（上）與Element Biosciences公司Trinity™測(cè)序儀機(jī)內(nèi)雜交工作流程（下）。

傳統(tǒng)雜交捕獲需經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的探針雜交、磁珠結(jié)合、多輪洗滌、雜交后擴(kuò)增、文庫(kù)質(zhì)控及混合等步驟，隨后才能進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。相比之下，Trinity技術(shù)流程直接將雜交探針加載至測(cè)序儀的芯片中，省去了磁珠捕獲、洗滌及雜交后擴(kuò)增環(huán)節(jié)，從而精簡(jiǎn)了靶向富集步驟。這一簡(jiǎn)化的工作流程在保持高效靶向富集與穩(wěn)定測(cè)序性能的同時(shí)，顯著減少了人工操作時(shí)間、縮短了實(shí)驗(yàn)周期，并降低了流程復(fù)雜度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：文庫(kù)質(zhì)控（QC）數(shù)據(jù)


圖5. 不同基因組DNA起始濃度下的最終文庫(kù)產(chǎn)量

采用SPT Labtech firefly液體處理平臺(tái)自動(dòng)化運(yùn)行的Twist FlexPrep™ 超高通量文庫(kù)制備與雜交試劑盒所得到的最終文庫(kù)產(chǎn)量（ng/μL）。

待測(cè)樣本選取了牛基因組DNA，按四種起始濃度（30、60、90及120 ng）分置于384孔板的四個(gè)象限中，以評(píng)估該體系流程對(duì)不同DNA起始濃度下文庫(kù)產(chǎn)出的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有起始濃度下均得到了相當(dāng)均一的文庫(kù)產(chǎn)量，體現(xiàn)了Twist NBL技術(shù)在均一化中的高效性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，在firefly平臺(tái)上自動(dòng)化運(yùn)行Twist FlexPrep工作流程無(wú)需預(yù)先進(jìn)行DNA定量與均一化處理，即可實(shí)現(xiàn)高度穩(wěn)定的文庫(kù)制備重復(fù)性。

圖6. 不同gDNA起始濃度下文庫(kù)片段大小的一致性

通過(guò)firefly自動(dòng)化Twist FlexPrep™ UHT工作流程，在四種基因組DNA起始濃度（30、60、90和120 ng）下制備的文庫(kù)所獲得的平均片段大小（bp）。

所有起始濃度下的文庫(kù)片段大小分布均保持一致，表明該流程體系具有穩(wěn)定且可重復(fù)的片段化與文庫(kù)制備能力，且不受起始樣本量的影響。這種高度均一性保障了文庫(kù)制備流程具備良好的可擴(kuò)展性與高通量適用性，能夠廣泛支持下游雜交、靶向富集及測(cè)序等各類應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：測(cè)序性能指標(biāo)


圖7. Trinity™ 測(cè)序儀“機(jī)內(nèi)雜交”的測(cè)序性能指標(biāo)

采用Twist FlexPrep™ UHT文庫(kù)制備流程、并通過(guò)Element Biosciences Trinity™測(cè)序儀進(jìn)行機(jī)內(nèi)雜交并測(cè)序，其靶向富集與測(cè)序性能指標(biāo)展示。

所列指標(biāo)包括：脫靶百分比、雜交文庫(kù)大小、重復(fù)序列百分比、平均靶向覆蓋深度、零覆蓋靶標(biāo)百分比及Fold-80堿基罰分。結(jié)果展示基于多個(gè)firefly自動(dòng)化文庫(kù)制備的混合樣品批次。所有指標(biāo)表現(xiàn)一致，表明整合的firefly–Twist–Element工作流程能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的雜交效率、均一的靶向覆蓋以及可重復(fù)的高質(zhì)量測(cè)序。