雞源雙抗平臺(tái)NKCE的親和力、表位覆蓋范圍及功能活性評(píng)估

本文來(lái)源于微信公眾： 生物制藥小編 作者： wothman

T細(xì)胞接合器（TCE）一直是雙抗領(lǐng)域中繞不開(kāi)的一座大山。

在這種類型的雙特異性抗體中，其中一端特異性通過(guò)其表面的CD3受體招募T細(xì)胞，另一端特異性通過(guò)腫瘤相關(guān)受體如EpCAM、CD19、CD20、BCMA、GPRC5D或DLL3結(jié)合癌細(xì)胞上的腫瘤相關(guān)抗原，從而實(shí)現(xiàn)將免疫細(xì)胞直接動(dòng)員至腫瘤部位，在那里它們激活免疫細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)不傷害健康細(xì)胞。

自從2014年以來(lái)，TCE已經(jīng)在血液腫瘤中獲得了驚人的成功，雖然有效，但是安全和劑量限制毒性問(wèn)題不可忽視。尤其是細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）常常會(huì)限制TCE雙抗的使用。

與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞無(wú)需預(yù)先致敏即可快速識(shí)別并摧毀異常細(xì)胞，且副作用相對(duì)溫和。采用NK細(xì)胞作為NK細(xì)胞接合器（NKCE）的策略已有多家Biotech企業(yè)嘗試開(kāi)發(fā)中。

最近OmniAb公司就在mAbs發(fā)布了該公司的NKCE平臺(tái)技術(shù)，不過(guò)讓人意想不到的是，這個(gè)技術(shù)平臺(tái)以“雞”這種動(dòng)物的抗體作為技術(shù)核心之一。

通用輕鏈和雞鼠平臺(tái)
開(kāi)發(fā)雙特異性抗體面臨一個(gè)主要技術(shù)難題：輕鏈錯(cuò)配。一個(gè)典型的抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。在實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)生產(chǎn)兩種不同的抗體“半成品”（分別針對(duì)A靶點(diǎn)和B靶點(diǎn)）時(shí)，它們的重鏈和輕鏈很容易隨機(jī)組合，產(chǎn)生四種組合，由于目標(biāo)只有一種，那么就產(chǎn)生了大量非目標(biāo)產(chǎn)物，嚴(yán)重影響純度和產(chǎn)量。

因此，科學(xué)界常常采用“共同輕鏈”（cmLC）技術(shù)，指的是靶向不同targets的不同抗體中所使用的輕鏈?zhǔn)且恢碌�。這樣，在組裝針對(duì)不同靶點(diǎn)的抗體時(shí)，就完全避免了輕鏈的混亂配對(duì)，使得大規(guī)模生產(chǎn)高質(zhì)量的雙特異性抗體成為可能。

2017年獲批的血友病藥物emicizumab（Hemlibra®）就是首款成功的cmLC雙抗。不過(guò)要如何快速篩選出這種cmLC雙抗呢？

研究團(tuán)隊(duì)采用兩個(gè)互補(bǔ)的動(dòng)物平臺(tái)，它們都能產(chǎn)生全人源序列的cmLC抗體。

OmniClic™ 和 OmniFlic®。它們都基于“通用輕鏈”（cmLC）技術(shù)，能產(chǎn)生完全人源序列的抗體，但宿主動(dòng)物截然不同——前者使用基因工程改造的雞，后者則使用大鼠。

哺乳動(dòng)物（包括人類和大鼠）通過(guò)V（D）J重組機(jī)制產(chǎn)生抗體多樣性，即從多個(gè)基因片段中隨機(jī)拼接出不同的重鏈和輕鏈。

而雞則采用一種名為“基因轉(zhuǎn)換”（gene conversion）的獨(dú)特機(jī)制：它們只有一個(gè)功能性重鏈V基因，但通過(guò)高頻替換其可變區(qū)，從一系列偽基因中拷貝小片段DNA來(lái)對(duì)其進(jìn)行修飾和多樣化，也能生成高度多樣化的抗體庫(kù)。

這種進(jìn)化上的“另類路徑”，使得雞對(duì)人類抗原可能產(chǎn)生與哺乳動(dòng)物完全不同的識(shí)別方式，從而挖掘出全新的抗體表位。而大鼠等哺乳動(dòng)物與人類更近緣，它們的免疫系統(tǒng)可能覺(jué)得NKp46似曾相識(shí)，從而跳過(guò)某些表位，限制了抗體表位多樣性。研究假設(shè)：聯(lián)合使用Clic和Flic平臺(tái)，可以獲得比任何單一平臺(tái)更全面、互補(bǔ)的抗體庫(kù)。

研究團(tuán)隊(duì)以NK細(xì)胞上的重要激活器NKp46為模型靶點(diǎn)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。他們分別用NKp46蛋白免疫OmniClic雞和OmniFlic大鼠，隨后從單個(gè)B細(xì)胞中分離出特異性抗體，并對(duì)其親和力、表位覆蓋范圍及功能活性進(jìn)行全面評(píng)估。

雞鼠互補(bǔ)
研究的核心突破在于對(duì)表位多樣性的深度解析。表位是抗原上被抗體識(shí)別的具體區(qū)域，不同表位的抗體可能觸發(fā)不同的生物學(xué)效應(yīng)。擁有針對(duì)多個(gè)不同表位的抗體，對(duì)于設(shè)計(jì)最優(yōu)化的療法至關(guān)重要。

團(tuán)隊(duì)采用高通量表面等離子共振（SPR）技術(shù)，對(duì)119個(gè)抗體克隆進(jìn)行了“表位分箱”（epitope binning）分析——即測(cè)試任意兩個(gè)抗體是否能同時(shí)結(jié)合NKp46，若不能，則說(shuō)明它們識(shí)別的是重疊或鄰近的表位。

研究結(jié)果顯示：OmniFlic大鼠平臺(tái)成功重現(xiàn)了文獻(xiàn)中已知的四個(gè)經(jīng)典NKp46抗體（Innate-1至4）所對(duì)應(yīng)的全部四個(gè)表位群；

而OmniClic雞平臺(tái)雖僅重現(xiàn)其中一個(gè)（Innate-2），卻發(fā)現(xiàn)了六個(gè)全新、鼠類平臺(tái)無(wú)法產(chǎn)生的獨(dú)特表位群，這證明了研究人員最初的假設(shè)，即使用雞源平臺(tái)能夠提供一個(gè)完全不同的視角來(lái)更好找到新表位；

兩個(gè)平臺(tái)共識(shí)別出14個(gè)不同的表位社區(qū)（communities），其中僅有2個(gè)為共享，其余均為各自獨(dú)有。

隨后，研究人員還利用氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）這項(xiàng)技術(shù)通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)主鏈氫原子與溶液中氘原子的交換速率，定位抗體結(jié)合后受保護(hù)的區(qū)域。

結(jié)果驗(yàn)證了SPR分箱結(jié)果的可靠性。如Com-4C1能結(jié)合L39-F62區(qū)域，與Innate-4基準(zhǔn)重疊。Com-3（如dAb D01）可結(jié)合H108-F121，位于蛋白遠(yuǎn)端的獨(dú)特口袋。Com-2a以L135-Y147為核心，但成員間有細(xì)微差異。最引人注目的是C08——一個(gè)Clic抗體，擁有從未見(jiàn)過(guò)的獨(dú)特表位（Com-2U），直接與Innate-1基準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)，這表明它結(jié)合了一個(gè)關(guān)鍵的功能區(qū)域。

ADCC實(shí)戰(zhàn)檢驗(yàn)
研究人員將三個(gè)代表性抗體（分別來(lái)自雞和鼠的不同表位群）改造為EGFR/NKp46雙特異性抗體，采用Morrison格式（2+2四價(jià)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)NKp46臂和兩個(gè)EGFR臂）。這種四聚體結(jié)構(gòu)像分子交聯(lián)劑，強(qiáng)制NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞親密接觸。利用經(jīng)典的A549肺癌細(xì)胞系和人源NK細(xì)胞進(jìn)行抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC）實(shí)驗(yàn)。

他們測(cè)試了兩種配置：將EGFR臂連接在NKp46抗體的重鏈或輕鏈末端，并使用活性Fc（結(jié)合CD16a）或“沉默”Fc。

他們發(fā)現(xiàn)了以下三種規(guī)律：
①所有測(cè)試的雙抗均能在無(wú)Fc效應(yīng)功能（即沉默F(xiàn)c，排除CD16a通路干擾）的情況下介導(dǎo)腫瘤殺傷，證明單純激活NKp46就足以觸發(fā)NK細(xì)胞殺傷活性。
②活性Fc未增效，最佳表現(xiàn)者反而是Flic來(lái)源的F15的沉默F(xiàn)c輕鏈連接版本，顯著優(yōu)于活性Fc版本，甚至超過(guò)西妥昔單抗對(duì)照。
③輕鏈大于重鏈，將EGFR-scFv連接在抗體輕鏈末端（LC-tethered）的格式，比連接在重鏈末端（HC-tethered）更有效。

傳統(tǒng)上，科學(xué)家通常認(rèn)為激活FcγRIIIa（CD16a）能增強(qiáng)ADCC。但在此系統(tǒng)中，同時(shí)激活NKp46和CD16a反而可能因空間位阻或信號(hào)干擾而降低效率。

這表明，在設(shè)計(jì)NKCE時(shí)，還需要考慮分子幾何結(jié)構(gòu)與價(jià)態(tài)問(wèn)題，并非激活越多就越好。

總結(jié)
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究證明了OmniClic平臺(tái)可以作為嚙齒類系統(tǒng)的可行替代，同時(shí)也說(shuō)明了NKCE開(kāi)發(fā)的復(fù)雜挑戰(zhàn)，還有更多的基礎(chǔ)研究有待開(kāi)發(fā)，期望未來(lái)NKCE相關(guān)平臺(tái)能有更好發(fā)展。