使用無標(biāo)記熒光偏振技術(shù)研究蛋白質(zhì)構(gòu)象和質(zhì)量變化

蛋白質(zhì)作為生命活動的主要承擔(dān)者，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)等領(lǐng)域中扮演著至關(guān)重要的角色。為了深入理解和利用蛋白質(zhì)的功能與特性，研究者們開發(fā)了一系列蛋白質(zhì)表征方法，包括電泳法、色譜法、質(zhì)譜法、光譜法、核磁共振等。
 
熒光偏振（ Fluorescence Polarization，F(xiàn)P）是一種基于酶標(biāo)儀的高級熒光檢測方法，通過外源熒光標(biāo)記（如 FITC）或者內(nèi)源熒光偏振光變化來研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化和分子間相互作用。因為色氨酸本身具有熒光特性，在紫外線光譜范圍內(nèi)可被有效激發(fā)，如果您正在研究的蛋白質(zhì)或者肽含有色氨酸，您可以參考本文使用安捷倫 BioTek Synergy H1 多功能酶標(biāo)儀結(jié)合無標(biāo)記熒光偏振技術(shù)來研究溶液中蛋白質(zhì)的構(gòu)象和質(zhì)量變化。
 
 
熒光偏振檢測原理

熒光偏振（FP）是一種熒光檢測技術(shù)，其原理在于觀察到熒光分子在受到水平方向偏振光激發(fā)時會發(fā)射水平方向偏振光。
 
在溶液中，蛋白質(zhì)可以自由旋轉(zhuǎn)，因此所發(fā)射的水平偏振光的方向會根據(jù)所使用熒光基團(tuán)的熒光壽命以及該分子在該時間段內(nèi)旋轉(zhuǎn)的程度而發(fā)生變化。分子的旋轉(zhuǎn)速度受溶液粘度、絕對溫度、分子體積以及氣體常數(shù)的影響。如果保持粘度和溫度不變，那么旋轉(zhuǎn)速度差異的關(guān)鍵變量就是分子體積，或者近似地說，就是分子量。
 
熒光偏振檢測時需同步檢測水平和垂直于激發(fā)偏振光方向的熒光強(qiáng)度來計算偏振值。任何熒光基團(tuán)復(fù)合物的偏振值都與該復(fù)合物分子的旋轉(zhuǎn)速度成反比。由于旋轉(zhuǎn)速度與分子大小有關(guān)，因此大分子復(fù)合物偏振值較高，而小分子的偏振值較低。
 
傳統(tǒng)方法常用熒光素或者羅丹明通過與肽或者核酸共價結(jié)合來作為示蹤劑，而本文介紹的研究方法直接利用了蛋白質(zhì)中色氨酸的天然熒光，因此無需任何化學(xué)修飾。
 
 
關(guān)于色氨酸的小知識
 
色氨酸具有吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)，最大吸收波長為 280nm，發(fā)射峰在 300-350nm 之間，具體取決于局部環(huán)境的極性。色氨酸是一種相對稀有的氨基酸，許多蛋白質(zhì)僅含有一個或者幾個色氨酸殘基，因此，色氨酸熒光偏振可以作為單個色氨酸殘基構(gòu)象狀態(tài)的靈敏測量指標(biāo)。與外源探針相比，其優(yōu)勢在于蛋白質(zhì)本身未發(fā)生改變。

材料與方法詳見 Application Note（文末掃描二維碼下載），我們直接來看數(shù)據(jù)與結(jié)果：
 
1.使用熒光偏振技術(shù)準(zhǔn)確區(qū)分不同質(zhì)量的分子
 
大分子和小分子混合物的熒光偏振值取決于它們的相對比例。大分子相對于小分子過量時，偏振值會較大；而小分子過量時，偏振值則較低。這一點通過將色氨酸氨基酸與人血清白蛋白（HSA）混合得到了證實。
  圖 2. 人血清白蛋白和色氨酸混合物在非變性條件下的偏振值。數(shù)據(jù)代表多次重復(fù)實驗中至少 8 個獨立測定的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
 
HSA 是一種 67kD 的蛋白質(zhì)，僅含一個色氨酸。但由于其體積較大，熒光偏振值會較高；相反，色氨酸氨基酸體積較小，偏振值較低。圖 2 展示了使用BioTek Synergy H1 配備紫外偏振模塊能夠區(qū)分不同濃度比的色氨酸和 HSA 的能力。以 HSA 為主的混合物的偏振值約為 175 mP，而以色氨酸為主的混合物的偏振值約為 40 mP。
 
 
2.使用熒光偏振技術(shù)監(jiān)測蛋白質(zhì)去折疊
 
色氨酸通常位于蛋白質(zhì)的疏水中心，作為三級結(jié)構(gòu)的一部分，這極大地限制了其相對于整個肽鏈獨立旋轉(zhuǎn)的能力。如果三級結(jié)構(gòu)完全變性，多肽鏈內(nèi)的色氨酸部分在聚合物內(nèi)具有一定的旋轉(zhuǎn)自由度，而這種自由度是天然肽鏈不一定具備的。
  圖 3. 非變性狀態(tài)與變性狀態(tài)下的偏振值對比。在非變性條件或變性條件（8 M 胍鹽或 10 M 尿素）下制備人血清白蛋白（HSA）與色氨酸的混合物，并測定其熒光偏振值。數(shù)據(jù)代表了來自多次實驗的至少 8 個重復(fù)樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖 3 所示：在變性劑作用下，HSA 逐漸去折疊偏振值顯著下降。與天然非變性條件下觀察到的最大 FP 值相比，顯著降低 40%。色氨酸含量較高的樣品不受影響。
  圖 4. 隨著胍鹽濃度增加人血清白蛋白的偏振值變化情況。人血清白蛋白（HSA）用不同濃度的胍鹽處理。孵育 30 分鐘后，測定紫外激發(fā)下的偏振值。數(shù)據(jù)代表來自多次實驗的至少 8 次獨立測定的平均值。

圖 4 則展示了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化對熒光偏振的影響。當(dāng) HSA 暴露于不斷增加濃度的變性劑時，偏振值起初約增加 10%，隨后顯著下降。這種增加是由于蛋白質(zhì)初步展開，使其分子體積增大所致，而下降則歸因于蛋白質(zhì)完全展開，使色氨酸殘基從蛋白質(zhì)的疏水核心中釋放出來，從而使吲哚環(huán)能夠獨立于蛋白質(zhì)旋轉(zhuǎn)。由于色氨酸仍是蛋白質(zhì)主鏈的一部分，所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)完全變性時，其偏振值仍顯著高于溶液中的色氨酸。
 
 
3.使用熒光偏振技術(shù)追蹤酶切過程
 
熒光偏振的本質(zhì)在于能夠區(qū)分質(zhì)量差異。用蛋白酶消化 HSA 后，會使蛋白質(zhì)逐漸分解成越來越小的肽段。由于 HSA 中只有一個色氨酸基團(tuán)，所以只有含該氨基酸的肽段具有熒光性。如圖 5 所示，在 100 μg/mL 或 500 μg/mL 蛋白酶消化 HAS 后，含色氨酸的肽段逐漸變短，偏振值隨時間下降，而不含蛋白酶的樣本則偏振值恒定，結(jié)果直觀反映了酶切動力學(xué)。
  圖 5. 蛋白酶消化后 HAS 偏振值隨時間的變化。在 37℃ 條件下，用 0、100、500 μg/mL 的蛋白酶處理（8 個重復(fù)），動力學(xué)測定熒光偏振。數(shù)據(jù)表示 8 個測定值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
 
 
4. 使用熒光偏振技術(shù)檢測聚合與組裝
 
蜂毒肽（melittin）是從蜂毒中提取的一種由 26 個氨基酸殘基組成的多肽，具有抑菌、抗病毒的作用，也常被用作研究蛋白質(zhì)折疊。將 100 μM 蜂毒肽與不同濃度的氯化鈉在 10mM 磷酸鹽（pH 7.5）緩沖液中室溫孵育 30min 后進(jìn)行熒光偏振檢測。結(jié)果顯示：隨著離子強(qiáng)度的增加，蜂毒肽從單體無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)?α-螺旋四聚體。形成二聚體和四聚體后，其旋轉(zhuǎn)質(zhì)量顯著增加。熒光偏振檢測結(jié)果實時地反映了其組裝過程。
  圖 8. 蜂毒多聚體形成。在 pH 6.5 下，增加氯化鈉濃度，孵育蜂毒肽 30 分鐘，測定其熒光偏振度。數(shù)據(jù)表示八次測定的平均值。
 
在這篇應(yīng)用指南中，Agilent BioTek Synergy H1 配合紫外偏振模塊，為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和相互作用提供了一種無需標(biāo)記、操作簡便、結(jié)果可靠的方法。無論是構(gòu)象變化、酶切過程，還是聚合組裝，它都能讓你“看得清楚，測得準(zhǔn)確”。
 
 
說在最后
 
熒光偏振在多功能酶標(biāo)儀的應(yīng)用中屬于一種高級熒光檢測實驗，需要特定的光學(xué)元件（例如起偏器）和高靈敏度的檢測光路，安捷倫 BioTek Synergy H1 作為多功能酶標(biāo)儀的“明星產(chǎn)品”，能夠通過模塊化配置，為熒光偏振、時間分辨熒光等高級熒光實驗提供可靠結(jié)果。
   
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