鄰位連接技術(shù)(PLA)的原理、實(shí)驗(yàn)流程及在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用

其核心技術(shù)原理在于：針對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性一抗分別與帶有互補(bǔ)序列的DNA探針的二抗結(jié)合。當(dāng)兩個(gè)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)空間距離接近（<40 nm）時(shí)，其連接的DNA探針隨之靠近，在連接酶作用下環(huán)化成完整的環(huán)形DNA模板。隨后通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）產(chǎn)生大量單鏈DNA重復(fù)序列，并使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行檢測(cè)。最終，熒光顯微鏡下的每個(gè)熒光信號(hào)點(diǎn)即代表一處蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)“所見(jiàn)即所得”的直觀分析。

二、PLA標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程

樣品制備：采用4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，以保持蛋白的原始空間構(gòu)象與互作狀態(tài)，隨后使用Triton X-100進(jìn)行溫和透化處理，確�？贵w能夠有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

抗體孵育：依次加入針對(duì)兩個(gè)目標(biāo)蛋白、來(lái)源于不同宿主的一抗，孵育后加入對(duì)應(yīng)物種特異的、偶聯(lián)有DNA探針的PLA二抗。

連接反應(yīng)：在連接酶作用下，當(dāng)兩個(gè)DNA探針因蛋白互作而空間鄰近時(shí)，其末端互補(bǔ)序列被連接形成閉環(huán)DNA模板。

滾環(huán)擴(kuò)增與熒光標(biāo)記：利用Phi29 DNA聚合酶進(jìn)行等溫滾環(huán)擴(kuò)增，生成包含大量重復(fù)序列的DNA產(chǎn)物，隨后加入熒光標(biāo)記的檢測(cè)探針進(jìn)行雜交標(biāo)記。

信號(hào)檢測(cè)與分析：使用共聚焦顯微鏡觀察樣本，每個(gè)互作事件顯示為一個(gè)離散的熒光點(diǎn)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光點(diǎn)數(shù)量，可實(shí)現(xiàn)對(duì)互作頻率的定量比較。

1. 細(xì)胞黏附與力學(xué)傳感機(jī)制
研究顯示，在肝癌細(xì)胞中，TNS1與整合素β1（ITGB1）的相互作用受細(xì)胞外基質(zhì)黏彈性調(diào)控。高黏彈性環(huán)境顯著增強(qiáng)PLA檢測(cè)到的互作信號(hào)，提示力學(xué)微環(huán)境可通過(guò)調(diào)控黏附復(fù)合物的組裝動(dòng)態(tài)影響細(xì)胞行為。

2. 晝夜節(jié)律與缺氧信號(hào)整合
在人心肌細(xì)胞中，PLA證實(shí)了生物鐘核心蛋白BMAL1與缺氧誘導(dǎo)因子HIF2A在細(xì)胞核內(nèi)存在特異性相互作用，其結(jié)合強(qiáng)度顯著高于BMAL1與HIF1A的互作，揭示了晝夜節(jié)律與缺氧應(yīng)答在轉(zhuǎn)錄水平上的直接耦合機(jī)制。

3. DNA損傷應(yīng)答與修復(fù)
研究利用PLA技術(shù)，在DNA損傷誘導(dǎo)的HeLa和U2OS細(xì)胞中，揭示了組蛋白H1.4的去酰胺化修飾（N76D/N77D）與DNA損傷標(biāo)志物γH2AX在損傷染色質(zhì)區(qū)域的高度共定位，為理解染色質(zhì)重塑在DNA損傷修復(fù)中的作用提供了直接證據(jù)。同時(shí)，PLA也用于驗(yàn)證RAD52與SMARCAL1在DNA復(fù)制應(yīng)激下的核內(nèi)互作，其信號(hào)可被RAD52抑制劑顯著抑制。

4. 轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突機(jī)制
在HeLa細(xì)胞中，PCNA與RNA聚合酶II（RNAPII）的核內(nèi)相互作用被PLA直接捕捉。當(dāng)TIPIN或TIMELESS等復(fù)制相關(guān)因子缺失時(shí)，PLA信號(hào)增強(qiáng)，直觀反映了轉(zhuǎn)錄-復(fù)制沖突（TRCs）的增加；該互作信號(hào)可被轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB顯著抑制。

5. 神經(jīng)與內(nèi)分泌系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)
在小鼠紋狀體的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，PLA揭示了µ-crystallin（Crym）與MAP2或USP9X在胞體及突起的特異性相互作用，且該互作在中央紋狀體區(qū)域顯著增強(qiáng)。此外，PLA證實(shí)了FGF23與FGFR1c/FGFR3c/FGFR4在HEK293T細(xì)胞膜表面的復(fù)合物形成。

6. 細(xì)胞器膜蛋白互作與質(zhì)量調(diào)控
PLA技術(shù)成功定位了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白ARL6IP1與FAM134B在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞及HEK293T細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)區(qū)域的相互作用，敲除任一蛋白均導(dǎo)致信號(hào)顯著減少，驗(yàn)證了其互作特異性。

7. 免疫調(diào)控與跨細(xì)胞互作
一項(xiàng)創(chuàng)新性研究利用PLA在T細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，檢測(cè)到TRAIL與死亡受體DR5在兩種細(xì)胞接觸界面上的特異性“膜-膜”相互作用，為理解免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞間的直接通訊提供了可視化證據(jù)。

8. 激酶信號(hào)與酶復(fù)合物形成
在H1299細(xì)胞中，PLA驗(yàn)證了ALK與RNase1在胞質(zhì)及近膜區(qū)域的相互作用，提示兩者可能形成功能性復(fù)合物參與信號(hào)傳導(dǎo)。

未來(lái)，隨著多色PLA、活細(xì)胞PLA成像以及與其他超分辨率成像技術(shù)聯(lián)用方案的發(fā)展，該技術(shù)將在解析動(dòng)態(tài)、多維的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，以及推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

五、PLA蛋白互作哪個(gè)品牌有？
樂(lè)備實(shí)LabEx提供PLA鄰位連接技術(shù)檢測(cè)服務(wù)：
PLA可視化蛋白互作試劑盒(點(diǎn)擊)
貨號(hào)：LXR-PLA

樂(lè)備實(shí)是國(guó)內(nèi)專(zhuān)注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專(zhuān)家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。