酶聯(lián)免疫斑點 (ELISPOT) 技術(shù)的原理、發(fā)展與應(yīng)用
細(xì)胞間通訊是維持細(xì)胞動力學(xué)與機(jī)體穩(wěn)態(tài)的核心過程。除直接接觸外，可溶性蛋白因子的分泌是細(xì)胞，尤其是免疫細(xì)胞，進(jìn)行信息交流的關(guān)鍵方式。因此，對蛋白質(zhì)分泌行為進(jìn)行精確測定，對于解析“免疫細(xì)胞社會學(xué)”至關(guān)重要。
傳統(tǒng)方法（如酶聯(lián)免疫吸附實驗，ELISA）僅能檢測細(xì)胞群體分泌蛋白的總濃度，無法揭示分泌該蛋白的細(xì)胞頻率及其活化狀態(tài)。酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)應(yīng)運而生，它能夠在單細(xì)胞水平上對蛋白質(zhì)分泌行為進(jìn)行可視化、定量分析，直接反映分泌特定蛋白的功能性細(xì)胞頻率，為評估細(xì)胞免疫應(yīng)答提供了獨特視角。
二、技術(shù)發(fā)展歷程ELISPOT技術(shù)的原理雛形出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代。1983年，Sedgwick與Czerkinsky兩個研究小組分別報道了利用固相酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測抗體分泌細(xì)胞的方法，后者首次明確提出了“ELISPOT”的概念。
技術(shù)發(fā)展初期，由于B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白量較大，易于檢測，應(yīng)用較為順利。然而，在T細(xì)胞研究領(lǐng)域，由于其所分泌的細(xì)胞因子量少、檢測抗體靈敏度不足及顯色膜材質(zhì)限制等因素，該技術(shù)一度面臨斑點不清、靈敏度低及重復(fù)性差等挑戰(zhàn)。直至1996年，Lehmann團(tuán)隊引入聚偏二氟乙烯膜作為固相載體，其卓越的蛋白吸附能力與顯色分辨率顯著提升了檢測靈敏度，推動了ELISPOT技術(shù)在T細(xì)胞免疫研究中的廣泛應(yīng)用。
三、ELISPOT技術(shù)的基本原理與流程ELISPOT技術(shù)基于高度特異性的抗原-抗體反應(yīng)，其標(biāo)準(zhǔn)化操作流程主要包含以下幾個核心步驟：
-
包被抗體： 將具有高親和力的捕獲抗體預(yù)先固定于多孔板底部，形成免疫吸附層。
-
細(xì)胞孵育與刺激： 將待測細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞）接種至板中，并在特定刺激物（如抗原、多肽或促有絲分裂原）存在下進(jìn)行培養(yǎng)，激活目標(biāo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子或其他蛋白。
-
靶蛋白捕獲： 細(xì)胞分泌的靶蛋白在擴(kuò)散至培養(yǎng)基之前，被其周圍的捕獲抗體立即捕獲，在細(xì)胞原位形成免疫復(fù)合物。
-
檢測與顯色： 移除細(xì)胞后，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，繼而加入酶標(biāo)記的鏈霉親和素。最后加入底物，酶催化底物在抗體捕獲位點產(chǎn)生不溶性的有色沉淀，形成斑點。
-
結(jié)果分析： 使用自動斑點分析系統(tǒng)或顯微鏡對斑點進(jìn)行計數(shù)，每一個斑點代表一個曾分泌靶蛋白的活性細(xì)胞。
四、ELISPOT與其他細(xì)胞因子檢測技術(shù)的比較
為全面評估細(xì)胞免疫反應(yīng)，多種技術(shù)平臺可供選擇。下表以T細(xì)胞免疫評估為例，對比了不同檢測平臺的特點：
表1. T細(xì)胞免疫評估常用檢測平臺比較
| 檢測方法 | 檢測水平 | 主要優(yōu)點 | 主要局限 |
|---|---|---|---|
| ELISPOT | 單細(xì)胞、分泌蛋白 | 靈敏度極高；可視化分泌細(xì)胞頻率；反映細(xì)胞功能活性 | 通常一次僅能檢測一種因子 |
| 細(xì)胞內(nèi)因子染色(ICS) | 單細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)蛋白 | 可結(jié)合表型進(jìn)行多參數(shù)分析 | 需使用分泌抑制劑；反映的是某個時間點的細(xì)胞內(nèi)儲存量 |
| ELISA | 群體水平、分泌蛋白 | 操作簡便，可定量濃度 | 無法區(qū)分分泌細(xì)胞的頻率 |
| 細(xì)胞因子微球檢測(CBA) | 群體水平、分泌蛋白 | 可多重檢測多種因子 | 無法進(jìn)行單細(xì)胞頻率分析 |
與其他技術(shù)相比，ELISPOT的核心優(yōu)勢在于其極高的靈敏度（可達(dá)百萬分之一）以及能夠檢測細(xì)胞實際分泌的功能性行為，而非細(xì)胞內(nèi)儲存。與ICS相比，ELISPOT無需使用分泌抑制劑，能夠持續(xù)捕獲整個孵育期內(nèi)細(xì)胞分泌的蛋白，更適于高通量篩選。
五、技術(shù)進(jìn)展與應(yīng)用前景為滿足日益復(fù)雜的研究需求，ELISPOT技術(shù)本身也在不斷發(fā)展。雙色顯色ELISPOT與多色熒光ELISPOT技術(shù)的成功開發(fā)，實現(xiàn)了在同一實驗中同時檢測兩種或多種蛋白的分泌，極大地擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。
目前，ELISPOT技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括但不限于：
- 疫苗免疫學(xué)評價（如腫瘤疫苗、病毒疫苗）
- 感染性疾病的免疫應(yīng)答監(jiān)測（如結(jié)核、HIV）
- 自身免疫性疾病的致病機(jī)理研究
- 移植免疫中的排斥反應(yīng)評估
- 腫瘤免疫治療的療效預(yù)測與監(jiān)測
- 過敏原的特異性反應(yīng)研究
綜上所述，ELISPOT作為一種高度靈敏、功能性的單細(xì)胞檢測技術(shù)，為深入理解機(jī)體免疫狀態(tài)提供了不可替代的研究工具，具有廣闊的臨床應(yīng)用與科研前景。
六、酶聯(lián)免疫斑點(Elispot)相關(guān)技術(shù)服務(wù)哪里有？
樂備實（LabEx）提供酶聯(lián)免疫斑點(Elispot)相關(guān)技術(shù)服務(wù)
| 酶聯(lián)免疫斑點（Elispot） | 細(xì)胞免疫學(xué)研究中高敏感檢測方法，可在單細(xì)胞水平對抗體分泌細(xì)胞（ASC）及細(xì)胞因子（CK）分泌細(xì)胞進(jìn)行檢測 | 1. 高靈敏度：百萬分之一陽性細(xì)胞檢測率，是 ELISA 和 RT-PCR 的 200 倍；
|
雙抗夾心原理：孔底 PVDF 膜包被單抗→加入淋巴細(xì)胞與刺激物過夜培養(yǎng)→分泌的細(xì)胞因子與包被單抗結(jié)合→去除細(xì)胞后加生物素標(biāo)記單抗及酶標(biāo)親和素反應(yīng)→酶底物顯色形成斑點 | 1. 免疫學(xué)基礎(chǔ)研究（T/B 細(xì)胞分析、Th0/Th1/Th2 細(xì)胞轉(zhuǎn)換）；
|
樂備實是國內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測以及組學(xué)分析服務(wù)的實驗服務(wù)專家，自2018年成立以來，樂備實不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺已擴(kuò)展到單細(xì)胞測序、空間多組學(xué)、流式檢測、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實驗的完整檢測體系。
