RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀在大腸埃希氏菌MPN計(jì)數(shù)法的應(yīng)用

方案摘要：借助 RAYPA 培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀完成檢測(cè)所需各類培養(yǎng)基/緩沖液的制備與分裝，替代傳統(tǒng)手動(dòng)操作，實(shí)現(xiàn)“稱量-溶解-滅菌-分裝-冷卻”全流程自動(dòng)化控制，保障無菌性與定量一致性。本方案以“樣品處理-梯度稀釋-三級(jí)發(fā)酵-結(jié)果判定”為核心邏輯，融入RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀優(yōu)勢(shì)優(yōu)化檢測(cè)流程。前期依托儀器實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化制備分裝，后續(xù)樣品處理以 RAYPA 預(yù)制液為基質(zhì)，確保 1:10 及系列稀釋精準(zhǔn)；初發(fā)酵、復(fù)發(fā)酵、確認(rèn)試驗(yàn)依托標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)基，保障產(chǎn)氣觀察、菌落識(shí)別準(zhǔn)確。最終結(jié)合 MPN 檢索表報(bào)告結(jié)果，因儀器保障各環(huán)節(jié)精準(zhǔn)無菌，檢測(cè)重復(fù)性與準(zhǔn)確性顯著提升，適配多批次檢測(cè)需求。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       大腸埃希氏菌 MPN 計(jì)數(shù)法，核心是基于概率統(tǒng)計(jì)的數(shù)量估算方法。其原理為：先對(duì)樣品做 10 倍梯度稀釋，選取連續(xù)稀釋度各接種多支選擇性培養(yǎng)管；經(jīng)培養(yǎng)后，依據(jù)大腸埃希氏菌分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特性判斷陽性管；最后根據(jù)各稀釋度陽性管分布組合，結(jié)合泊松分布原理，查閱 MPN 表推算出樣品中該菌的最可能數(shù)量。
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
① RAYPA培養(yǎng)基自動(dòng)制備分裝儀;
② Pipetty Pro 非等量電動(dòng)移液器:MSIC12-01-1000;
③ 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1℃;
④ 冰箱:2 ℃~8 ℃;
⑤ 恒溫水浴箱:44.5 ℃±0.2 ℃;
⑥ 恒溫裝置:48 ℃±2℃;
⑦ 天平:感量 0.1g;
⑧ 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯,振蕩器;
⑨ 試管:15 mmX150 mm、18 mmX180 mm 、以及小倒管(杜氏管）;
 ⑩ 無菌錐形瓶:容量 500 mL;
⑪ 無菌培養(yǎng)皿:直徑 90 mm;
⑫ pH 計(jì)或精密 pH 試紙;
⑬ 無菌接種環(huán):10 μL。
 
2、試劑和材料
① 磷酸鹽緩沖液;
② 生理鹽水;
③ 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯;
④ EC 肉湯;
⑤ 胰蛋白胨膽鹽 X-葡萄糖醛酸苷(TBX)瓊脂;
⑥ 1 mol/I NaOH;
⑦ 1 mol/L HCl。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
① 通過 RAYPA 儀器自動(dòng)完成磷酸鹽緩沖液、生理鹽水的制備與定量分裝（精準(zhǔn)設(shè)定 225mL /份、9mL/份規(guī)格），儀器內(nèi)置無菌程序，避免手動(dòng)分裝污染，同時(shí)為后續(xù)樣品稀釋提供精準(zhǔn)基質(zhì)。
 
② RAYPA 自動(dòng)完成原料稱量、高溫滅菌后，將LST 肉湯及EC 肉湯精準(zhǔn)分裝至無菌試管，分裝過程全程密閉，避免雜菌污染，且每管培養(yǎng)基液面高度一致，保障產(chǎn)氣觀察準(zhǔn)確性。​
③ RAYPA自動(dòng)完成瓊脂溶解、溫度調(diào)控后，定量分裝至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，避免手動(dòng)傾倒導(dǎo)致的厚度不均問題，保障后續(xù)菌落觀察清晰度。
 
2、樣品處理與梯度稀釋
① 固體和半固體樣品:無菌操作稱取 25g樣品,放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min~10 000 r/min 均質(zhì)1 min~2 min;或放入盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min,制成 1:10 的樣品勻液。
② 液體樣品:用無菌吸管吸取 25 mL樣品置于盛有 225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中充分混勻,或放入盛有 225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2 min,制成1:10的樣品勻液。
③ 必要時(shí)用1 mol/L, NaOH 或1 mol/L HC1,調(diào)節(jié)樣品勻液或液體樣品原液的 pH 至 6.5~7.5。
④ 用移液器吸取1:10 樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入裝有9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中,將試管在振蕩器上振蕩混勻,制成1:100的樣品勻液。
 
⑤ 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),依次制成 10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支無菌吸頭。
3、初發(fā)酵試驗(yàn)
每個(gè)樣品,選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液,每個(gè)稀釋度接種3管LST肉湯,每管LST肉湯接種1mL樣品勻液。從制備樣品勻液開始至接種至LST肉湯完畢,全過程不得超過15 min。將已接種樣品的 LST肉湯管置于 36 ℃±1 ℃培養(yǎng) 24 h±2h,檢查產(chǎn)氣情況。小倒管或產(chǎn)氣收集裝置內(nèi)有氣泡產(chǎn)生,或輕輕振搖LST肉湯管可見試管內(nèi)有細(xì)密氣泡不斷上升者,判斷為產(chǎn)氣,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn);培養(yǎng)至48 h+2h,仍未產(chǎn)氣者判斷為大腸埃希氏菌陰性。若培養(yǎng)至 48 h±2h,所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣,MPN 檢索表,報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸埃希氏菌的 MPN值,以 MPN/g(mL)表示。 
4、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)
輕輕振搖各產(chǎn)氣的LST肉湯管,分別用接種環(huán)取培養(yǎng)物1環(huán),轉(zhuǎn)種至EC肉湯管中,放入帶蓋的水浴箱內(nèi)。水浴箱的水面至少高于 EC肉湯培養(yǎng)基液面1cm~2cm,44.5 ℃±0.2 ℃培養(yǎng) 24 h±2h,檢查產(chǎn)氣情況,如未見產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h±2 h。記錄 48 h±2h內(nèi)所有產(chǎn)氣的 EC肉湯管數(shù),并進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。若培養(yǎng)至 48 h±2 h,所有 EC肉湯管均未產(chǎn)氣,判斷為大腸埃希氏菌陰性,按照MPN 檢索表,報(bào)告每克(亳升)樣品中大腸埃希氏菌的 MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。
5、確認(rèn)試驗(yàn)
輕輕振搖各產(chǎn)氣的 EC肉湯管,分別用接種環(huán)取培養(yǎng)物劃線接種于 TBX瓊脂平板,36 ℃±1℃培養(yǎng) 18 h~24 h,觀察 TBX瓊脂平板上的菌落,大腸埃希氏菌在 TBX 瓊脂平板上的菌落為藍(lán)綠色。TBX瓊脂平板上有藍(lán)綠色菌落者,其對(duì)應(yīng)的EC肉湯產(chǎn)氣管為大腸埃希氏菌陽性,否則為陰性。
 
四、結(jié)果報(bào)告
依據(jù)3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度中大腸埃希氏菌的陽性管數(shù),按照MPN 檢索表。報(bào)告每克(毫升)樣品中大腸埃希氏菌的 MPN 值,以 MPN/g(mL)表示。