in vivo CAR T（體內(nèi)CAR-T）進(jìn)行概念驗(yàn)證的技術(shù)方案

2025 年 9 月 17 日，首次使用 mRNA-LNP 的  in vivo CAR-T臨床研究結(jié)果在NEJM發(fā)表（In Vivo CD19 CAR T-Cell Therapy for Refractory Systemic Lupus Erythematosus），初步實(shí)現(xiàn)了LNP途徑的人體概念驗(yàn)證；

圖.2025 年 9 月 17 日NEJM

這里分享一篇靶向CD3/CD7的tLNP  in vivo CAR-T驗(yàn)證思路和內(nèi)容：

1.首先是轉(zhuǎn)染效率，對比了靜息狀態(tài)和預(yù)激活狀態(tài)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染情況，結(jié)果是雙靶向tLNP-CD7/CD3在靜息T細(xì)胞和預(yù)激活T細(xì)胞中均表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)染效率（這里發(fā)現(xiàn)雖然tLNP-CD7無法促進(jìn)mcDNA遞送至靜息T細(xì)胞，但它能夠高效轉(zhuǎn)染激活T細(xì)胞，比tLNP-CD3還高）；

圖1.轉(zhuǎn)染效率對比

2.其次是靶向效應(yīng)，看下靶向T細(xì)胞的特異性（c圖顯示所有PBMC里T細(xì)胞的攝取明顯升高，d圖顯示單獨(dú)的CD3 靶向明顯不如增加CD7的表達(dá)特異性強(qiáng)）；這里關(guān)注到非靶向LNP在各個(gè)PBMC亞群中也有攝取和mRNA表達(dá)，還有在LNP中靶向CD7的同時(shí)也增強(qiáng)了NK細(xì)胞的攝取和mRNA表達(dá)；

圖2.靶向?qū)Ρ?/span>

3.基于上面的基礎(chǔ)，作者開發(fā)了共同遞送編碼CAR的mcDNA和SB100x轉(zhuǎn)座酶mRNA，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的體內(nèi)CAR-T工程；

圖3.設(shè)計(jì)成品展示

4.接下來就是測試產(chǎn)品的表達(dá)穩(wěn)定性，殺傷及效靶比，作者開發(fā)了共同遞送編碼CAR的mcDNA和SB100x轉(zhuǎn)座酶mRNA，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的體內(nèi)CAR-T表達(dá)及殺傷；

圖4.產(chǎn)品體外測試

5.動物實(shí)驗(yàn)部分作者使用了人源化小鼠腫瘤模型（Nalm6-luci腫瘤細(xì)胞）；藥效測試時(shí)提前一周接種腫瘤細(xì)胞（接種量是5×10^5），48h后進(jìn)行PBMC移植（人源化5×10^6），5天后進(jìn)行靜脈給藥（模型的給藥窗口4周左右，給藥組有1只17天死于麻醉，實(shí)驗(yàn)人員也不想呀），給藥后21天外周血CART達(dá)到峰值，終點(diǎn)時(shí)骨髓和脾臟均有24%的表達(dá)量，腫瘤抑制作用明顯。

在做劑量探索時(shí)先提前11天進(jìn)行人源化接種（PBMC移植5×10^6），注射前8天接種腫瘤細(xì)胞（接種量是5×10^5）（這點(diǎn)改動值得討論，細(xì)心的讀者能發(fā)現(xiàn)），低劑量探索發(fā)現(xiàn)40 µg/kg或（4 µg/kg）依然能對腫瘤細(xì)胞有抑制作用，其中40ug/kg抑制作用更明顯。

作者補(bǔ)充材料中也做了雙靶點(diǎn)CD19 和 CD22 CAR（NCtx-dual）的研究和小鼠模型測試，均能展現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制作用；50 µg/kg 劑量的 NCtx-dual 外周血CART細(xì)胞增殖達(dá)50,000 /µL；

圖5.產(chǎn)品體內(nèi)測試

6.為了更進(jìn)一步模擬人體環(huán)境，作者使用了人類 CD34+ 造血干細(xì)胞移植的 NCG 小鼠模型 (NCG-His)；該模型更貼合人類免疫細(xì)胞群的發(fā)育，且不會像在 PBMC 移植小鼠中那樣快速發(fā)生GVHD。

這次直接測試雙靶點(diǎn)CD19 和 CD22 CAR（NCtx-dual）劑量50 µg/kg，給藥前2天接種腫瘤細(xì)胞（接種量是5×10^5），24h后進(jìn)行 200 ng IL-7腹腔注射。

治療組共12只小鼠，至給藥后42天有7只完全緩解，而對照組動物均在Day28天死亡；

這次作者檢測了T細(xì)胞(PD-1的表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)明顯的 CAR T 細(xì)胞耗竭跡象；基于CD45RA 和 CD62L表達(dá)的 T 細(xì)胞分化分析顯示到第40天轉(zhuǎn)變?yōu)榉只�程度更低更有利于完全緩解和持久性的TCM表型。

圖6.產(chǎn)品體內(nèi)測試Plus