Nature分享：發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫新靶點并通過藥物篩選與合成進行臨床轉(zhuǎn)化

文章來源公眾號：課題指南針               作者：課題指南針

目前腫瘤免疫是熱門研究方向，但是研究來研究去可能就那幾個關(guān)鍵的通路和靶點，那么如何發(fā)現(xiàn)新靶點呢？一起來看下這篇最新的Nature文章是如何從0到1發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫新靶點，并通過藥物篩選與合成新的靶點小分子抑制劑進行臨床轉(zhuǎn)化：NNMT inhibition in cancer-associated fibroblasts restores antitumour immunity，即抑制癌癥相關(guān)成纖維細胞中的NNMT可恢復(fù)抗腫瘤免疫力。

癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAFs）在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中扮演關(guān)鍵角色，但針對CAFs的療法尚不明確�；�于此，作者通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細胞RNA測序技術(shù)，探討了NNMT在卵巢癌進展中的作用。研究發(fā)現(xiàn)NNMT誘導(dǎo)的H3K27me3低甲基化促進了CAFs分泌補體，吸引免疫抑制性髓源性抑制細胞（MDSCs）至腫瘤，從而影響腫瘤生長。通過基因敲除和高通量篩選，研究者開發(fā)出一種強效特異的NNMT抑制劑，該抑制劑能減少腫瘤負擔(dān)和轉(zhuǎn)移，并恢復(fù)免疫檢查點阻斷療效。

1、表型發(fā)現(xiàn)：臨床樣本和數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)NNMT在不同癌種的CAF中高表達
研究團隊運用多維度研究策略，首先通過對30名高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）患者構(gòu)建的組織芯片進行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，同時結(jié)合7例HGSOC患者大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶的單細胞測序數(shù)據(jù)，構(gòu)建了完整的CAF亞型圖譜，成功鑒定出8種不同的癌相關(guān)成纖維細胞（CAF）亞群；分析結(jié)果顯示煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（NNMT）的mRNA和蛋白表達水平呈現(xiàn)出從癌旁正常組織到原發(fā)腫瘤間質(zhì)再到轉(zhuǎn)移灶的逐級升高趨勢，且這種表達模式在所有8種CAF亞型中都保持一致的高表達特征；進一步的免疫組化定量分析和免疫熒光共定位顯示，NNMT高表達區(qū)域與CD8⁺ T細胞數(shù)量減少呈顯著負相關(guān)；為了驗證這一發(fā)現(xiàn)的普適性，研究人員還深入分析了多個公共泛癌單細胞數(shù)據(jù)庫（包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等），發(fā)現(xiàn)NNMT在不同癌種的CAF中都存在保守的高表達模式。

2、表型驗證：腫瘤基質(zhì)的NNMT敲除抑制腫瘤生長
研究團隊在多種免疫健全的全身性NNMT敲除（Nnmt⁻/⁻）小鼠腫瘤模型中驗證其抗腫瘤效果：在Nnmt⁻/⁻小鼠的卵巢癌模型中，通過原位卵巢內(nèi)注射HGS-2細胞或腹腔注射ID8細胞，最終小鼠的原發(fā)卵巢腫瘤重量和網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶重量均顯著低于野生型對照組，并且在腫瘤重量尚未出現(xiàn)顯著差異的早期Nnmt⁻/⁻小鼠腫瘤中CD8⁺ T細胞數(shù)量顯著增加，同時活化T細胞（體外經(jīng)PMA/離子霉素刺激后產(chǎn)生IFN-γ和TNF）比例明顯升高；在E0771-LMB乳腺癌模型（乳腺脂肪墊原位接種）、MC38結(jié)腸癌模型（皮下接種）、尾靜脈注射E0771-LMB細胞的肺轉(zhuǎn)移模型中均得到相同結(jié)果。

通過抗體介導(dǎo)的CD8⁺ T細胞耗竭實驗，發(fā)現(xiàn)清除CD8⁺ T細胞后，Nnmt⁻/⁻小鼠的抗腫瘤效應(yīng)完全消失，證明其抑瘤效果是CD8⁺ T細胞依賴性的。

骨髓嵌合體小鼠實驗結(jié)果表明造血細胞中的Nnmt敲除不會改變腫瘤負荷，受體小鼠Nnmt缺陷抑制了腫瘤生長，并導(dǎo)致產(chǎn)生細胞因子的CD8+T細胞豐度增加；此外，相比于Nnmt敲除的成纖維細胞，Nnmt正常表達的成纖維細胞與E0771-LMB細胞原位共注射到Nnmt⁻/⁻小鼠乳腺脂肪墊中誘導(dǎo)的腫瘤更大，證明成纖維細胞而非造血細胞中的NNMT表達驅(qū)動腫瘤生長。

3、機制探究：表達NNMT的成纖維細胞通過補體分泌招募MDSCs
為了闡明NNMT如何介導(dǎo)免疫抑制，研究人員建立了NNMT過表達的NIH-3T3成纖維細胞模型（3T3-NNMT），通過RNA測序分析發(fā)現(xiàn)其基因表達譜中與髓系細胞遷移、活化和補體激活相關(guān)的通路顯著富集；蛋白質(zhì)組學(xué)分析細胞培養(yǎng)上清液顯示，3T3-NNMT細胞分泌的補體成分（包括C3、C1QA、C1QB、C1QC、CFB等）顯著增加，其中C3蛋白的分泌量增加了近5倍；在MC38結(jié)腸癌模型中，Nnmt⁻/⁻小鼠腫瘤組織中的C3蛋白水平顯著低于野生型小鼠，證實了體內(nèi)情況與體外實驗的一致性；功能實驗表明，3T3-NNMT的條件培養(yǎng)基能夠強力誘導(dǎo)Ly6Cʰⁱᵍʰ單核細胞的Transwell遷移，遷移細胞數(shù)量是對照組的3倍以上，而當使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除C3基因后，這種趨化效應(yīng)被顯著抑制；進一步研究發(fā)現(xiàn)，這種單核細胞招募主要通過C5a-C5aR軸介導(dǎo)，因為使用C5aR拮抗劑能夠完全阻斷遷移效應(yīng)，而C3aR拮抗劑則無此作用；流式細胞術(shù)分析顯示，在MC38和ID8腫瘤模型中，Nnmt⁻/⁻小鼠腫瘤內(nèi)的Ly6Cʰⁱᵍʰ單核細胞和Ly6CⁱⁿᵗF4/80⁺CD206⁺腫瘤相關(guān)巨噬細胞數(shù)量顯著減少，這兩種細胞都是已知的CD8⁺ T細胞強力抑制細胞。

4、分子機制探究：NNMT驅(qū)動CAFs的表觀遺傳變化
研究人員深入探究了NNMT調(diào)控CAF功能的分子機制，發(fā)現(xiàn)NNMT通過消耗甲基供體SAM創(chuàng)造了一個"甲基化陷井"：在低甲硫氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的3T3-NNMT細胞中，Western blot分析顯示組蛋白H3K27me3水平顯著降低，這表明NNMT過度表達確實導(dǎo)致了全局性的低甲基化狀態(tài)；ChIP-seq分析進一步揭示了這種表觀遺傳改變的具體基因組分布，發(fā)現(xiàn)H3K27me3的峰值大小在3T3-NNMT細胞中顯著減小，特別是在多個已知的促癌CAF基因（如編碼補體成分和細胞外基質(zhì)蛋白的基因）的啟動子區(qū)域；RNA-seq分析顯示，這些表觀遺傳變化伴隨著基因表達譜的顯著改變，包括多種CAF標志物（如α-SMA、MHC II、Ly6C）的上調(diào)，這表明NNMT表達足以誘導(dǎo)成纖維細胞獲得CAF樣表型；有趣的是，通過補充甲硫氨酸（SAM的前體）可以恢復(fù)SAM水平并阻止組蛋白低甲基化，同時顯著減弱NNMT驅(qū)動的補體因子C3和Cfb的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，這進一步證實了NNMT通過甲基代謝調(diào)控表觀遺傳的機制。

5、臨床轉(zhuǎn)化：治療策略開發(fā)與臨床前評估
通過建立高通量篩選平臺，研究團隊采用MTase-Glo法（檢測SAM向SAH的轉(zhuǎn)化）對包含152,778種化合物的化學(xué)庫進行初步篩選，經(jīng)過劑量反應(yīng)驗證和化學(xué)聚類分析，選定先導(dǎo)化合物并進行了一系列藥物化學(xué)優(yōu)化，共合成了350多個結(jié)構(gòu)類似物，最終獲得了IC₅₀值低于10 nM的NNMT特異性抑制劑（NNMTi），并同步合成了活性降低200倍以上的非活性對映體（NNMTi-D）作為嚴格的陰性對照；在藥效學(xué)評估中，研究人員采用了多種給藥途徑（腹腔注射、瘤內(nèi)注射、口咽吸入）和多種小鼠腫瘤模型（HGS-2卵巢癌、MC38結(jié)腸癌、E0771-LMB乳腺癌），結(jié)果顯示NNMTi單藥治療能夠顯著降低腫瘤負荷（抑瘤率達60-80%）和轉(zhuǎn)移發(fā)生率，并通過LC-MS/MS檢測證實腫瘤內(nèi)1-MNA水平劑量依賴性下降；深入的機制研究表明，NNMTi治療后腫瘤微環(huán)境發(fā)生顯著重塑：免疫組化和流式細胞術(shù)分析顯示α-SMA⁺ myCAFs和Ly6C⁺ iCAFs等促癌CAF亞群比例下降，H3K27me3水平回升，C3蛋白分泌減少，Ly6CʰⁱᵍʰPD-L1ʰⁱᵍʰ M-MDSCs數(shù)量減少約50%，而活化的CD8⁺ T細胞（CD69⁺IFN-γ⁺）數(shù)量增加2-3倍；最令人鼓舞的是，當NNMTi與臨床常用免疫檢查點抑制劑（抗PD-1抗體或抗CD47抗體）聯(lián)合使用時，在多種模型中均觀察到顯著的協(xié)同效應(yīng)，聯(lián)合治療組腫瘤完全消退率可達40%，且能有效逆轉(zhuǎn)E0771-LMB等免疫治療耐藥模型的治療抵抗，為臨床轉(zhuǎn)化提供了強有力的實驗依據(jù)。​