GSDMD的前世今生
在討論實驗方案之前，我們先來回顧下GSDMD的前世今生。GSDMD屬于Gasdermin（GSDM）蛋白家族，除GSDMD外，還包含 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDME/DNFA5 和 PVJK/GSDMF 蛋白，是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的新型蛋白質(zhì)。GSDM家族被認為與免疫反應(yīng)相關(guān)的孔形成有關(guān)。具有 C 端抑制結(jié)構(gòu)域、細胞毒性的N 端結(jié)構(gòu)域和柔性連接結(jié)構(gòu)域（GSDMF 除外）。其中，GSDM-N端結(jié)構(gòu)域可被剪切并釋放出來，在細胞膜上形成大的寡聚孔，從而促進細胞的分解。[1]
目前的研究表明，GSDMs 參與調(diào)控各種生理和病理過程，如細胞分化、凝血、炎癥和腫瘤發(fā)生。蛋白 GSDME 和 GSDMA 也與自身免疫性疾病和某些癌癥有關(guān)。大多數(shù) GSDMs蛋白被認為具有形成孔隙的能力。其中研究最深入的成員GSDMD蛋白已被確認為細胞焦亡的執(zhí)行者[2]。焦亡是一種溶解性細胞死亡的炎癥形式，它是在形成 caspase-1 激活的炎癥體后誘發(fā)的。其特點是一種由 GSDM家族蛋白介導(dǎo)，激活 NOD 樣受體蛋白 3（NLRP3）炎性體，形成細胞膜孔，釋放 IL-1β 和 IL-18 [3,4]。然后由促炎性Caspases通過經(jīng)典和非經(jīng)典炎性體信號通路裂解的GSDMD蛋白生成GSDMD-N末端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N），再由GSDMD-N迅速插入質(zhì)膜形成活性孔[5,6]。因此，GSDMD-N 充當(dāng)了細胞焦亡的最終執(zhí)行者。
實驗細節(jié)
由于 GSDMD在細胞焦亡和自身免疫性疾病的炎癥中有可能存在作為驅(qū)動因素的潛力，是一個極具吸引力的藥物靶點，GSDMD成為目前研究的熱點之一。今天小優(yōu)細節(jié)君就來和大家一分享一下，WB實驗中，檢測GSDMD的一些小經(jīng)驗。
在WB實驗中，最常遇到的問題莫過于無條帶和有雜帶這兩大類，下面我們展開說說。
01 實驗結(jié)果無GSDMD條帶或信號很弱
GSDMD存在多種蛋白形式，包括約53 kDa附近的GSDMD前體、約31kDa的剪切體GSDMD-N、約22 kDa的剪切體GSDMD-C等，在多數(shù)的情況下無需藥物處理即可在樣本中檢測到GSDMD前體蛋白，雖然GSDMD在不同的樣本中廣泛表達，但由于表達水平可能有差異或者受到一些處理方式的影響，在檢測時也會有可能出現(xiàn)無條帶或信號弱的情況。這時我們可以先確定一下樣本的表達水平，通過查詢數(shù)據(jù)庫、文獻，或者進行qPCR實驗作為參考。
相比較全長GSDMD蛋白的檢測，GSDMD-N的檢測難度則更大一些。從前文的介紹中，我們不難發(fā)現(xiàn)，GSDMD的打孔功能主要是由N-端結(jié)構(gòu)域執(zhí)行的，而GSDMD-N需要經(jīng)過Caspases剪切產(chǎn)生,因此具有活性的GSDMD-N片段通常需要適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)才能產(chǎn)生。下圖展示了未處理的小鼠BMDM和經(jīng)LPS和Nigericin處理后的小鼠BMDM樣本中，GSDMD-N的檢測情況。可以看到在未處理或僅經(jīng)LPS處理的樣本中，無法檢出GSDMD-N條帶，而在不同濃度Nigericin的處理下GSDMD-N條帶信號強度也有變化。
結(jié)合以上結(jié)果，我們在進行誘導(dǎo)處理時，可以留意觀察一下一些表觀變化，以期能檢出理想的信號條帶。在誘導(dǎo)處理時，如果可以通過肉眼觀察到細胞死亡，并且鏡檢時能觀察到細胞漲大，胞質(zhì)泄露等經(jīng)典的細胞焦亡形態(tài)特征，則更有可能檢測到GSDMD-N條帶。另外細胞在發(fā)生焦亡時，貼壁性會降低，可能導(dǎo)致部分細胞在洗滌后丟失。建議離心收集細胞培養(yǎng)液中的脫落細胞，并使用PBS將培養(yǎng)板上的細胞全部刮出離心后，一起裂解。
在判斷誘導(dǎo)條件干擾時，還有一個小方法，即，如果使用的一抗是可以同時識別全長和剪切體GSDMD的，那么可以看下結(jié)果中53KD附近的全長條帶是否正常。如全長蛋白正常顯影，而30KD附近無信號，則可以推斷誘導(dǎo)條件需要適當(dāng)調(diào)整。
而更直接的排查方法，是使用陽性樣本設(shè)置對照組，進行平行實驗，這樣不僅能排查樣本自身方面的干擾項，還能同步排查實驗中的操作和試劑干擾，高效的解決實驗問題。
02 雜帶干擾影響結(jié)果判讀
出現(xiàn)雜帶的時候，我們首先要判斷一下這些雜帶是否為靶標(biāo)條帶相關(guān)，如條帶的信號強度符合誘導(dǎo)處理的變化趨勢，則有可能是蛋白降解或者一抗為多克隆抗體引入的干擾，可以更換新鮮制備的樣本和單抗進行實驗。并且如果檢測樣本為組織樣本，成分比細胞樣本會更加復(fù)雜，也可能會引入雜帶干擾。如果想要進一步確定條帶的特異性，還可以通過更換樣本、設(shè)置陰性對照以及設(shè)計敲除實驗進行驗證。
另外，如果靶標(biāo)蛋白的表達量較低，需要經(jīng)長時間曝光顯影也有可能會導(dǎo)致雜帶和高背景的情況出現(xiàn)。值得一提的是，在檢測剪切體GSDMD-N/C時，建議同時檢測全長前體蛋白以便更準(zhǔn)確的判斷變化趨勢，作進一步的分析
部分相關(guān)產(chǎn)品：
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產(chǎn)品貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
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Gasdermin D (E9S1X) Rabbit mAb |
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Gasdermin D (E8G3F) Rabbit mAb |
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Cleaved Gasdermin D (Asp276) (E3E3P) Rabbit mAb |
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Cleaved Gasdermin D (Asp275) (E7H9G) Rabbit mAb |
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Gasdermin D (E4M2W) Rabbit mAb |
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Cleaved Gasdermin D (Gly276) (E9U7H) Rabbit mAb |
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Cleaved Gasdermin D (Asp275) (E7H9G) Rabbit mAb (BSA and Azide Free) |
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Rabbit anti-GSDMD Polyclonal Antibody |
參考文獻：
[1] The Versatile Gasdermin Family: Their Function and Roles in Diseases
[2] Gasdermins and their role in immunity and inflammation
[3] Shi J, et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 2015;526(7575):660–665. doi: 10.1038/nature15514. - DOI - PubMed
[4] Kuang S, et al. Structure insight of GSDMD reveals the basis of GSDMD autoinhibition in cell pyroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(40):10642–10647. doi: 10.1073/pnas.1708194114. - DOI - PMC – PubMed
[5] Xu B, et al. Gasdermin D plays a key role as a pyroptosis executor of non-alcoholic steatohepatitis in humans and mice. J Hepatol. 2018;68(4):773–782. doi: 10.1016/j.jhep.2017.11.040. - DOI - PubMed
[6] De Vasconcelos NM, et al. Single-cell analysis of pyroptosis dynamics reveals conserved GSDMD-mediated subcellular events that precede plasma membrane rupture. Cell Death Differ. 2019;26(1):146–161. doi: 10.1038/s41418-018-0106-7. - DOI - PMC - PubMed
