DMF受限下綠色二元溶劑體系助力多肽高效合成
背景：DMF受限，綠色替代迫在眉睫
2023年12月，歐盟REACH法規(guī)正式將N,N-二甲基甲酰胺（DMF）列入限制清單，禁止其在多個領域中使用。DMF作為固相多肽合成（SPPS）中的“黃金溶劑”，因其優(yōu)異的極性和反應效率被廣泛應用，但其高毒性、對環(huán)境的持久性以及對操作人員的健康威脅，促使全球科研界加速尋找綠色、安全、性能相當?shù)奶娲軇?/span>
最新突破：綠色二元溶劑體系 + 高溫感應加熱合成策略
意大利佛羅倫薩大學與Gyros Protein Technologies公司聯(lián)合開展的研究，系統(tǒng)評估了多種綠色溶劑組合，最終提出以二甲基亞砜（DMSO）為核心的二元溶劑體系，結合PurePep® Chorus多肽合成儀的感應加熱（Induction Heating, IH）技術，成功實現(xiàn)了對DMF的高效替代，并在多個挑戰(zhàn)性肽段的合成中表現(xiàn)出更優(yōu)或相當?shù)暮铣尚逝c純度。
研究設計：從溶劑篩選到合成驗證，層層遞進
1 溶劑體系篩選與優(yōu)化
研究團隊依據GSK綠色溶劑選擇指南，設定以下篩選標準：
- 氨基酸溶解度 ≥ 0.4 M
- 沸點 > 100°C（防止高溫蒸發(fā)）
- 黏度 < 4 mPa·s（適配自動化設備）
- 樹脂膨脹性 > 4 mL/g（保障反應效率）
經系統(tǒng)評估，最終優(yōu)選出以下三種二元溶劑組合：
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溶劑組合 |
體積比 |
特點 |
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DMSO / 乙酸丁酯（BuOAc） |
3:7 |
高沸點、低黏度、溶解性強 |
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DMSO / 丙酸丁酯（PrOAc） |
3:7 |
極性適中，適合多種氨基酸 |
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DMSO / 苯甲醚（Anisole） |
2:8 |
低毒性，適合高溫反應 |
2 模型肽合成驗證：高溫顯著提升合成效率
研究選取三種模型肽進行合成驗證：
- ACP (65–74)：常用于評估合成效率的標準肽
- A10K：具有自組裝特性的聚丙氨酸肽
- AlaSTD：非挑戰(zhàn)性參考肽
合成結果：
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肽段 |
室溫DMF純度 |
高溫BuOAc/DMSO純度 |
提升幅度 |
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ACP |
65.5% |
88.8% |
↑35.6% |
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A10K |
73.5% |
78.5% |
↑6.8% |
|
AlaSTD |
74.4% |
87.5% |
↑17.6% |
圖 1 在 90°C 下，用不同溶劑體系合成的 ACP(65–74) 的 RP-UHPLC 色譜圖對比
圖 2 在90°C下，采用不同溶劑體系合成的聚丙氨酸（polyALA）的RP-UHPLC色譜圖對比
圖 3 90°C下，以不同溶劑體系合成的 AlaSTD 的 RP-UHPLC 色譜圖對比
結論：在高溫條件下，綠色溶劑體系不僅可實現(xiàn)對DMF的替代，更在多個模型肽的合成中顯著提升了粗品純度。
3 挑戰(zhàn)性肽段合成：β-淀粉樣肽與SARS-CoV-2 RBM
β-淀粉樣肽（1–42）
- 特點：42個氨基酸，極易聚集，合成難度大
- 合成條件：90°C，BuOAc/DMSO體系
- 結果：粗品純度達61.7%，優(yōu)于DMF（59.7%）
- 經PEC®純化后，純度提升至84%
圖 4 使用 DMF 合成的粗品 β-淀粉樣蛋白 (1-42) 的 RP-UHPLC色譜圖
圖 5 使用 DMF 合成并經PEC®處理后的 β-淀粉樣蛋白 (1-42) 的 RP-UHPLC 色譜圖
SARS-CoV-2 RBM（436–507）
- 特點：72個氨基酸，親水/疏水區(qū)域交替，β-折疊傾向強
- 合成策略：雙次耦合 + 雙倍當量
- 結果：BuOAc/DMSO體系粗品純度達42.6%，優(yōu)于DMF（26.1%）
- 經PEC®純化后，純度達71%
圖 6 使用 DMF 合成的72聚肽 RBM436-507 的 RP-UHPLC 譜圖
圖 7 使用 DMF 合成并經PEC®處理后，72 聚肽 RBM436-507 的 RP-UHPLC 色譜圖
PurePep® Chorus：綠色合成的核心平臺
本研究所有合成實驗均在PurePep® Chorus自動化多肽合成儀上完成，其優(yōu)勢包括：
- 感應加熱（IH）技術：升溫迅速、控溫精準，適配所有溶劑體系
- 振蕩+氮氣混合：確保反應均勻，減少副反應
- 6通道并行合成：提升實驗通量與重復性
- 兼容綠色溶劑：自動校準體積，適應不同黏度
- 集成PEC®純化模塊：實現(xiàn)合成-純化一體化，大幅減少溶劑使用
- 消旋化（Racemization）評估：安全性可控
究對易消旋的組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）進行了系統(tǒng)評估：
- 使用DIC/Oxyma Pure耦合體系，在DMSO/BuOAc體系中，消旋水平與DMF相當或更低
- 推薦使用Fmoc-His(Boc)-OH而非Fmoc-His(Trt)-OH，以進一步降低消旋風險
圖 8 消旋研究
綠色純化：PEC®技術引領環(huán)保新方向
傳統(tǒng)RP-HPLC純化過程溶劑消耗大、廢液多。本研究引入PurePep EasyClean（PEC®）技術，采用可還原斷裂的連接子與功能化吸附樹脂，實現(xiàn)：
- 溶劑使用量減少約85%
- 純化時間縮短至7小時以內
- 純度提升顯著：β-淀粉樣肽從62%提升至84%，RBM從43%提升至71%
總結：綠色合成不再是“可選項”，而是“必由之路”
本研究系統(tǒng)驗證了一種基于DMSO的綠色二元溶劑體系，結合PurePep® Chorus合成平臺與PEC®純化技術，不僅成功擺脫了對DMF的依賴，更在合成效率、肽段純度、操作安全性與環(huán)境友好性方面實現(xiàn)了全面提升。
