文章解讀：in vivo CAR-T療法中VivoVec慢病毒遞送系統(tǒng)的研究

文章來源公眾號(hào)：落花微雨的知識(shí)樹 作者：心字疊衣

最近，in vivo CAR-T療法無(wú)疑成為了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的話題！從學(xué)術(shù)會(huì)議到投資論壇，從科研論文到媒體報(bào)道，這股熱潮幾乎席卷了整個(gè)生命科學(xué)界。網(wǎng)絡(luò)上關(guān)于這項(xiàng)技術(shù)的討論呈現(xiàn)出明顯的兩極分化——支持者視其為癌癥治療的終極解決方案，質(zhì)疑者則對(duì)其安全性和商業(yè)化前景持保留態(tài)度。但無(wú)論爭(zhēng)議如何，in vivo CAR-T療法的迅猛發(fā)展本身就說明了其巨大的潛力和價(jià)值。

作為科研工作者，我們更需要透過現(xiàn)象看本質(zhì)。與其被外界的喧囂所干擾，不如靜下心來深入研讀幾篇高質(zhì)量的文獻(xiàn)，從基礎(chǔ)機(jī)制到臨床數(shù)據(jù)，從技術(shù)瓶頸到未來方向，真正理解這項(xiàng)技術(shù)的核心所在。今天，就讓我們一起開啟這場(chǎng)in vivo CAR-T的文獻(xiàn)探索之旅！

這是2024年8月份發(fā)表在blood的一篇文章：In vivo CAR T-cell generation in nonhuman primates using lentiviral vectors displaying a multidomain fusion ligand. 雖然這不是最新的文獻(xiàn)，但是VivoVec是Umoja Biopharma開發(fā)的慢病毒遞送系統(tǒng)，所以這篇文獻(xiàn)還是值得學(xué)習(xí)一下的。說起來，這是解讀的第二篇，第一篇詳見：文獻(xiàn)閱讀[1]-CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury

01：文章前言
文章里作者提到了目前普通CAR-T制備的問題：一個(gè)主要的問題制備復(fù)雜，需要從每個(gè)患者身上收集大量的T細(xì)胞，將細(xì)胞運(yùn)送到專門的制造中心，通過進(jìn)行體外基因編輯和T細(xì)胞擴(kuò)增，將其制備成最終的產(chǎn)品，期間需要進(jìn)行QC，最終才能將CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品回輸。這一過程導(dǎo)致了在初始T細(xì)胞收集和最終產(chǎn)品回輸之間存在大量的等待期。此外，CAR-T回輸前也需要進(jìn)行清淋，而且有時(shí)候伴隨著較大的毒性，需要住院治療。目前CAR-T細(xì)胞的制備和給藥過程的復(fù)雜性，以及高昂的成本使得只有一小部分符合條件的患者可以獲得CAR-T細(xì)胞治療。

基于此，作者開發(fā)了VivoVec系統(tǒng)：
基礎(chǔ)載體類型：是第三代自失活慢病毒載體。這類載體經(jīng)過基因工程改造，刪除病毒復(fù)制所需基因，且啟動(dòng)子區(qū)域具有自失活設(shè)計(jì)，可降低插入突變風(fēng)險(xiǎn)，符合臨床安全性要求。

表面展示的功能元件：
1）載體表面展示抗CD3單鏈可變片段。該scFv是人工設(shè)計(jì)的抗體片段，能特異性結(jié)合T細(xì)胞表面的CD3分子，實(shí)現(xiàn)載體對(duì)T細(xì)胞的靶向性結(jié)合。

2）偽型化包膜蛋白：載體采用低密度脂蛋白受體趨向性的cocal融合糖蛋白進(jìn)行偽型化：cocal糖蛋白是囊泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)的結(jié)構(gòu)類似物，但具有更強(qiáng)的生物學(xué)特性：抗血清滅活能力，相比傳統(tǒng)VSV-G包膜，cocal蛋白能抵抗人體補(bǔ)體系統(tǒng)的中和作用，確保載體在體內(nèi)循環(huán)時(shí)保持穩(wěn)定，避免被快速清除。病毒的cocal通過與細(xì)胞表面的LDLR識(shí)別，從而將CAR基因傳遞到T細(xì)胞內(nèi)。

3）同時(shí)表達(dá)CD80和CD58共刺激配體；

02：文章正文
2.1 VVPs displaying CD80 and CD58 generate greater numbers of CAR T cells with increased in vitro and in vivo antitumor functionality.
抗原遞呈細(xì)胞同時(shí)向T細(xì)胞提供peptide-MHC抗原呈遞和共刺激信號(hào)，從而使得T細(xì)胞活化。這些信號(hào)對(duì)于確保T細(xì)胞激活，促進(jìn)分化，獲得效應(yīng)功能和形成長(zhǎng)期記憶至關(guān)重要。CD28和CD2，以及它們各自的配體CD80和CD58，是構(gòu)成T細(xì)胞-抗原提呈細(xì)胞的關(guān)鍵共刺激信號(hào)。作者猜測(cè)，在先前展示抗CD3 scFv的VVPs中加入CD80和CD58共刺激配體，將增強(qiáng)其激活T細(xì)胞的能力，從而產(chǎn)生具有改善抗腫瘤功能的CAR T細(xì)胞。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者構(gòu)建了VVPs和共表達(dá)CD80和CD58的VVPs，并在體外培養(yǎng)的健康人PBMCs中評(píng)估2種共刺激配體的作用（S1A-B）。不同于典型的使用抗CD3/CD28磁珠刺激的體外制備CAR-T細(xì)胞的方案，VVPs直接添加到PBMCs中，而不需要任何外源性刺激。共刺激分子的加入大大增強(qiáng)了病毒顆粒結(jié)合T細(xì)胞的能力（S1C）。

而且共刺激分子的加入也導(dǎo)致短期T細(xì)胞活化增強(qiáng)，這里是VVPs加入三天后，通過流式檢測(cè)CD25的表達(dá)水平驗(yàn)證的（1A）。

而且共刺激分子的加入也導(dǎo)致T細(xì)胞釋放了更多的細(xì)胞因子，包括IFNγ，IL-2和TNF-α（S1D）。

不論是否含共刺激配體的VVPs都能產(chǎn)生相似比例的CAR-T細(xì)胞（S1E）。

但是有共刺激配體的VVPs可以產(chǎn)生更多的CAR-T細(xì)胞（1B）。

表型上，表達(dá)共刺激分子的VVPs產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞表面表達(dá)更多的CCR7和CD27（S1F）。這兩個(gè)marker是記憶性T細(xì)胞群相關(guān)的標(biāo)志物，與體外CAR-T細(xì)胞治療的臨床反應(yīng)呈正相關(guān)�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，含有CD80和CD58共刺激配體的VVPs表現(xiàn)出增加的T細(xì)胞結(jié)合和激活，從而導(dǎo)致更多的CAR-T細(xì)胞生成，并具有較低分化的T細(xì)胞表型。

將表達(dá)或不表達(dá)共刺激分子的VVPs產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞分別與Nalm-6細(xì)胞以不同的ET比共培養(yǎng)，24小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)。表達(dá)共刺激分子的VVPs組的CAR-T細(xì)胞比單獨(dú)表達(dá)抗CD3 scFv的VVPs產(chǎn)生的IFNγ的量相似，但I(xiàn)L2和TNF-α的水平更高（1C）。

表達(dá)共刺激分子的VVPs組的CAR-T細(xì)胞與Nalm-6細(xì)胞共培養(yǎng)后，CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增的也更多。這里是由CellTrace dilution來判斷的。從圖中可以看到，Costim組的CellTrace的熒光都偏弱，說明這個(gè)組的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增更強(qiáng)，造成CellTrace Dye被稀釋（S1G）。

將VivoVec生成的抗CD19 CAR-T細(xì)胞（分兩組：含共刺激分子CD80/CD58的VVPs vs. 僅含anti-CD3 scFv的VVPs）與表達(dá)CD19的腫瘤細(xì)胞（Nalm6）共培養(yǎng)。每2-4天移除舊培養(yǎng)基，重新添加新鮮腫瘤細(xì)胞（圖中箭頭表示刺激時(shí)間點(diǎn)），持續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞數(shù)量變化（通過熒光標(biāo)記定量）。含共刺激分子的VVPs組的CAR-T細(xì)胞持續(xù)抑制腫瘤生長(zhǎng)，即使在多次刺激后仍能有效控制腫瘤細(xì)胞數(shù)量（圖中藍(lán)色曲線維持低位）。僅含anti-CD3 scFv的VVPs組，隨刺激次數(shù)增加，腫瘤細(xì)胞逐漸增殖（紅色曲線上升），表明CAR-T細(xì)胞功能衰竭或持久性不足（1D）。

雌性Nod.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ小鼠（這個(gè)小鼠重度免疫缺陷導(dǎo)致T/B細(xì)胞缺失；IL2rg基因敲除缺乏NK細(xì)胞；MHC I/II雙敲除）。Day -4，通過 尾靜脈注射 2.5E5個(gè) Nalm6細(xì)胞。Day -1，用 IVIS測(cè)量小鼠腫瘤負(fù)荷。根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)分組，確保組間基線一致。通過腹腔注射2E7個(gè)PBMCs。Day 0，腹腔注射攜帶CAR基因的 VivoVec病毒顆粒（劑量根據(jù)分組調(diào)整），體積200 μL（S1E）。

VVP給藥4天后，取小鼠的外周血，通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析人源CD3+ T細(xì)胞表面CD25和CD71的表達(dá)水平，評(píng)估其活化狀態(tài)。1E的橫坐標(biāo)代表的是不同VivoVec病毒顆粒的注射劑量，單位為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU）。與體外研究結(jié)果一致，表達(dá)帶有共刺激配體的抗CD3 scFv的VVPs比單獨(dú)表達(dá)抗CD3 scFv的VVPs誘導(dǎo)了更強(qiáng)的T細(xì)胞活化，且呈劑量依賴性。VVP給藥11天后檢測(cè)外周血中CAR-T細(xì)胞頻率。用含共刺激配體的抗CD3 scFv的VVPs處理的動(dòng)物顯示出更多的CAR-T細(xì)胞數(shù)量（1F-G）。最后，對(duì)腫瘤負(fù)荷進(jìn)行評(píng)估，使用共刺激配體表達(dá)抗CD3 scFv的VVPs治療，在VivoVec病毒顆粒較低劑量下腫瘤抑制作用就很強(qiáng)了（1H）。

2.2 An MDF protein comprising costimulatory molecules enhances T-cell activation and transduction.
作者設(shè)計(jì)了一種包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白（MDF）：包括CD58、抗CD3 scFv和CD80組成的單鏈長(zhǎng)肽。這樣可以簡(jiǎn)化VVPs的制備，并且成功將MDF成功展示在病毒表面（S2A）。

出乎意料的是，與單獨(dú)的抗CD3 scFv或含有共刺激分子的病毒顆粒相比，MDF VVPs與T細(xì)胞的結(jié)合要更多（2A），并導(dǎo)致更高的T細(xì)胞CD25表達(dá)（2B）。

但是MDF VVPs病毒顆粒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子并沒有明顯增加（S2B）。

值得注意的是，MDF VVPs在體外能更有效地產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞，尤其是在低感染復(fù)數(shù)時(shí)(2C)。

與含有共刺激分子的病毒顆粒相比，MDF VVPs制備的CAR-T細(xì)胞表面表達(dá)相當(dāng)?shù)腃CR7和CD27記憶細(xì)胞標(biāo)志物（S2C）。

接下來就是，與表達(dá)共刺激分子的VVPs組相比，MDF VVP產(chǎn)生的抗CD19 CAR-T細(xì)胞在與Nalm6細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增的量差不多（2E），IFNγ產(chǎn)生量差不多（2D），但產(chǎn)生更多的IL-2和TNF-α（2D），提示MDF VVP產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞可能具有更好的功能性。在連續(xù)刺激實(shí)驗(yàn)中，MDF VVP產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞能夠更好地控制Nalm6腫瘤的生長(zhǎng)（2F）。

在連續(xù)刺激實(shí)驗(yàn)中，MDF VVP產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞甚至優(yōu)于使用傳統(tǒng)的CD3/CD28 beads為基礎(chǔ)的刺激方案產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞(S2D)。

2.3 MDF VVPs exhibit enhanced in vivo functionality in a humanized mouse leukemia model.
作者再次使用NSG MHC I/II KO模型驗(yàn)證MDF VVP的抗腫瘤作用。 VVP給藥4天后，取小鼠的外周血，通過流式細(xì)胞術(shù)定量分析人源CD3+ T細(xì)胞表面CD25和CD71的表達(dá)水平，評(píng)估其活化狀態(tài)。與體外研究結(jié)果一致，MDF VVPs比表達(dá)共刺激的VVPs誘導(dǎo)了更強(qiáng)的T細(xì)胞活化，且呈劑量依賴性（3A）。VVP給藥11天后，作者觀察到兩種病毒顆粒在血液中產(chǎn)生了相似比例的CAR-T細(xì)胞，但MDF VVPs病毒顆粒可以產(chǎn)生更多的CAR-T細(xì)胞數(shù)目（3B）。這里與Figure1相比，3B中CAR-T細(xì)胞的數(shù)目明顯少了很多，作者給出的解釋是因?yàn)椴煌琩onor不一樣的原因。

雖然兩種病毒顆粒均能控制腫瘤生長(zhǎng)，但MDF VVPs在控制腫瘤生長(zhǎng)和總生存期方面表現(xiàn)略好。

這在10E6個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的較低劑量時(shí)尤為明顯，MDF VVPs治療動(dòng)物的中位生存期為90.5天，而表達(dá)共刺激分子的病毒顆粒組的中位生存期為62天（3D）。值得注意的是，在50E6個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的較高劑量下，MDF VVP處理的動(dòng)物在研究期間達(dá)到了100%的存活率。這些數(shù)據(jù)表明，在這個(gè)模型中，展示MDF蛋白的VVPs相對(duì)于表達(dá)抗CD3 scFv和表達(dá)共刺激配體的VVPs具有更好的抗腫瘤效果。

2.4 MDF VVPs administered intranodally induce potent and prolonged B-cell depletion in NHPs.

人源化小鼠模型具有局限性，并不能完全再現(xiàn)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的完整程度，特別是完全缺乏正常發(fā)育的次級(jí)淋巴組織和對(duì)異種移植物抗宿主病的易感性。為了解決這些局限性，作者在M nemestrina中開發(fā)了一個(gè)NHP模型，因?yàn)樵撐锓N允許用HIV-1衍生的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。在這個(gè)模型中，作者使用了一種NHP/人交叉反應(yīng)的抗CD20 CAR，此前已經(jīng)證明在恒河猴體內(nèi)使用體外制造的CAR-T細(xì)胞可以消除B細(xì)胞。為了使MDF蛋白適用于該模型，作者將抗人CD3 scFv替換為抗NHP CD3 scFv。人的CD58和CD80保留下來，因?yàn)檫@兩種蛋白在這兩個(gè)物種中的序列具有高度同源性（S3A）。

評(píng)估MDF VVPs的NHP替代物對(duì)M.nemestrina CD4和CD8 T細(xì)胞的結(jié)合、激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行體外驗(yàn)證（S3B）。與靶細(xì)胞LLC-MK2-NLO+/-CD20共培養(yǎng)，驗(yàn)證CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞殺傷功能（S3C）�？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，NHP MDF VVPs結(jié)合、激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)NHP T細(xì)胞的能力與人MDF VVPs相當(dāng)。

NHP模型：簡(jiǎn)言之，通過淋巴結(jié)注射，將攜帶抗CD20 CAR負(fù)載的NHP MDF VVPs以不同劑量注射到4只動(dòng)物的淋巴管系統(tǒng)。與靜脈給藥途徑相比，選擇淋巴結(jié)給藥途徑可以實(shí)現(xiàn)有效的病毒顆粒與T細(xì)胞相互作用，同時(shí)減少全身組織對(duì)游離病毒顆粒的暴露。動(dòng)物每周取血1-2次，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒顆粒誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化、CAR表達(dá)和隨后的B細(xì)胞耗竭。同時(shí)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行CRS和ICANS體征監(jiān)測(cè)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，作者既沒有清淋，也沒有額外補(bǔ)充細(xì)胞因子。其中，1只動(dòng)物(Z20020)接受了低劑量的VVPs（原劑量的五分之一）。

給藥后7天，4只動(dòng)物中有3只觀察到NHP MDF VVP誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化（4A）。在這3只動(dòng)物中，NHP MDF VVP給藥效果顯著，在第10天產(chǎn)生的CAR T細(xì)胞占循環(huán)T細(xì)胞的比例高達(dá)65% (4B)，相當(dāng)于每微升血液中含有5963875和11182個(gè)CAR-T細(xì)胞。低劑量組的Z20020, 作者沒有觀察到明顯的T細(xì)胞活化，CAR的表達(dá)，也沒有觀察到B細(xì)胞的消除。

正如預(yù)期的那樣，到第7天，在所有檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞的動(dòng)物中，循環(huán)B細(xì)胞都檢測(cè)不到了。說明CAR-T細(xì)胞大量產(chǎn)生與B細(xì)胞消除是同時(shí)出現(xiàn)的（4C-D）。相比之下，在產(chǎn)生CAR-T細(xì)胞的3只動(dòng)物中，循環(huán)B細(xì)胞的丟失是一致的，也非常持久。在治療后的第56、63和76天，循環(huán)B細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到（Z19051稍微差一點(diǎn)，B細(xì)胞在63和76還是能看到一點(diǎn)B細(xì)胞）。值得注意的是，1只動(dòng)物( Z20106 )在第49天顯示出大量的血液CAR T細(xì)胞的重新擴(kuò)增，以應(yīng)對(duì)在研究的第42天明顯的少量B細(xì)胞的再次出現(xiàn)。這表明VivoVec產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞具有持久性，這預(yù)示著記憶性CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生。與記憶性T細(xì)胞的形成一致，B細(xì)胞也在第二只動(dòng)物的第43天( Z19078 )的循環(huán)中重新出現(xiàn)，然后在第49天再次丟失。直到第63天，B細(xì)胞在該動(dòng)物中仍然檢測(cè)不到，這表明抗原特異性記憶CAR-T細(xì)胞功能持續(xù)存在。

在CRS方面，作者在血液(S3E)中檢測(cè)到，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的前不久就會(huì)觀察到C反應(yīng)蛋白(CRP)水平升高，這表明這是CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的，而不是病毒顆粒導(dǎo)致的。這是短暫的，隨著CAR-T細(xì)胞在第14天從血液中消失，CRP水平正�；�。如上所述，1只動(dòng)物在第49天經(jīng)歷了血液CAR-T細(xì)胞的回升(4C)，這也再次伴隨著CRP的短暫升高。IL-6，鐵蛋白和溫度遵循類似的規(guī)律。除了CRS癥狀，作者在前2只動(dòng)物中觀察到輕微的震顫和短暫的癲癇。這些事件是短暫的，與第10天觀察到的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增峰值相吻合。給予托珠單抗和阿那白滯素治療后震顫消失。作者沒有觀察到任何明顯的肝臟毒性的跡象，與谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶，堿性磷酸酶仍然保持在正常水平，除1只動(dòng)物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶在第1天出現(xiàn)短暫輕度升高外（S3F）。

取VVP治療最長(zhǎng)時(shí)間(139天)的1只動(dòng)物進(jìn)行剖檢，20種不同組織通過ddPCR評(píng)估載體基因組整合。在注射的部位inguinal lymph node和緊接著的medial iliac lymph node可以檢測(cè)到抗CD20 CAR轉(zhuǎn)基因。但是在其它組織中并沒有檢測(cè)到，這表明在VivoVec處理后，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞主要被隔離在注射和鄰近的淋巴結(jié)中幾個(gè)月（4E）。

作者通過RNA ISH檢測(cè)了CAR基因的生物分布（S3G）。與ddPCR數(shù)據(jù)一致，作者在注射的部位inguinal lymph node和緊接著的medial iliac lymph node可以檢測(cè)到極少數(shù)細(xì)胞中CAR的表達(dá)。還在脾臟、骨髓和肺中檢測(cè)到低水平的信號(hào)，作者認(rèn)為這些信號(hào)是CAR+細(xì)胞向這些部位轉(zhuǎn)運(yùn)的標(biāo)志。此外別的組織內(nèi)依然檢測(cè)不到�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，VivoVec通過淋巴內(nèi)注射，在沒有清淋的情況下，可以在免疫健全的NHP中有效地生成CAR-T細(xì)胞。生成的CAR-T細(xì)胞功能強(qiáng)大，導(dǎo)致B細(xì)胞清除長(zhǎng)達(dá)76天。

03：方法參考
3.1 Vector production：
將5種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)的HEK 293T細(xì)胞：gag pol(編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼、酶等）); rev(協(xié)助病毒RNA轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核); cocal(編碼低密度脂蛋白受體嗜性的病毒包膜糖蛋白（替代VSV-G）); MDF(編碼多域融合蛋白); payload(攜帶目標(biāo)CAR轉(zhuǎn)基因, 如抗CD20 CAR)。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后加入含15 U/mL Denarase（一種核酸酶）的新鮮培養(yǎng)基，降解殘留DNA/RNA以降低粘度并提高載體純度。次日收獲上清，用陰離子交換層析（Mustang Q色譜柱）初步純化，通過切向流過濾濃縮并置換緩沖液，通過0.2 μm PES濾膜除菌過濾，最后分裝冷凍最終病毒載體產(chǎn)品（VVPs）。
3.2 Particle binding： 
PBMCs與病毒顆粒在室溫下共培養(yǎng)1-4 h，每毫升病毒對(duì)應(yīng)2E7個(gè)細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（也就是MOI）為2-10。使用anti-cocal antibody通過流式評(píng)估病毒顆粒/T細(xì)胞結(jié)合。這里的cocal是表達(dá)在VVPs病毒顆粒表面的糖蛋白，病毒顆粒與細(xì)胞共孵育后短時(shí)間內(nèi)（1-4小時(shí)）進(jìn)行的檢測(cè)。這個(gè)時(shí)間點(diǎn)主要發(fā)生的是病毒顆粒與細(xì)胞表面的特異性結(jié)合（通過MDF蛋白），還來不及發(fā)生高效的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)。此時(shí)檢測(cè)到的cocal信號(hào)幾乎完全來源于附著在T細(xì)胞表面的完整病毒顆粒上的cocal包膜糖蛋白，并非來源于T細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)或產(chǎn)生的cocal蛋白（T細(xì)胞本身不表達(dá)cocal）。
3.3 In vitro PBMC transduction：
病毒顆粒直接加入到PBMCs中，按照每毫升對(duì)應(yīng)2E6個(gè)PNMCs細(xì)胞。分別在第3天和第7天用流式檢測(cè)激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)情況。
3.4 In vitro PBMC transduction： 
取5E4個(gè)CAR-T細(xì)胞，使用CellTrace Violet熒光染料（這種染料可穿透細(xì)胞膜，與胞內(nèi)蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，用于追蹤細(xì)胞分裂。而且細(xì)胞每分裂一次，熒光強(qiáng)度減半）進(jìn)行標(biāo)記。將標(biāo)記后的CAR-T細(xì)胞與5E4個(gè)Nalm6腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)。培養(yǎng)體系使用X-VIVO無(wú)血清培養(yǎng)基（不含IL-2,以排除外源細(xì)胞因子對(duì)增殖的干擾）。5天后通過流式檢測(cè)存活的CAR+細(xì)胞（通過死活染料排除死亡細(xì)胞，再通過CAR特異性抗體確認(rèn)轉(zhuǎn)導(dǎo)成功），以及通過CellTrace Violet熒光強(qiáng)度的稀釋程度，熒光強(qiáng)度越低，說明細(xì)胞分裂次數(shù)越多。這樣結(jié)果用于量化CAR-T細(xì)胞在腫瘤抗原刺激下的增殖能力。
3.5 PBMC-humanized mouse model： 
雌性Nod.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ小鼠（這個(gè)小鼠重度免疫缺陷導(dǎo)致T/B細(xì)胞缺失；IL2rg基因敲除缺乏NK細(xì)胞；MHC I/II雙敲除）。Day -4，通過 尾靜脈注射 2.5E5個(gè) Nalm6細(xì)胞。Day -1，用 IVIS測(cè)量小鼠腫瘤負(fù)荷。根據(jù)腫瘤大小隨機(jī)分組，確保組間基線一致。通過腹腔注射2E7個(gè)PBMCs。Day 0，腹腔注射攜帶CAR基因的 VivoVec病毒顆粒（劑量根據(jù)分組調(diào)整），體積200 μL。監(jiān)測(cè)指標(biāo)腫瘤負(fù)荷和血液中的CAR T細(xì)胞生成及免疫細(xì)胞變化。這里作者用腹腔注射PBMC的原因是什么？腹腔內(nèi)含大網(wǎng)膜、腸系膜淋巴結(jié)等次級(jí)淋巴器官，是免疫細(xì)胞歸巢和激活的理想場(chǎng)所。注入腹腔的PBMCs可通過 腹膜淋巴管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)（需2-5天）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，Day -1注射PBMCs后，Day 0給予VivoVec，預(yù)留了T細(xì)胞遷移至淋巴組織的時(shí)間。但是如果靜脈注射，PBMCs可能滯留肺部或脾臟，腹腔注射則提供更穩(wěn)定的局部微環(huán)境。
3.6 NHP model： 
該實(shí)驗(yàn)將編碼抗CD20 CAR的VivoVec載體顆粒（VVPs）直接注射到豬尾獼猴的淋巴結(jié)內(nèi)（最多4個(gè)，每處≤1mL）。每日監(jiān)測(cè)，記錄動(dòng)物的體溫、活動(dòng)狀態(tài)、食欲、糞便情況和整體健康狀況。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理規(guī)范，每日監(jiān)測(cè)動(dòng)物生理狀態(tài)，并在特定時(shí)間點(diǎn)采血進(jìn)行流式分析（檢測(cè)CAR T細(xì)胞生成、免疫細(xì)胞表型等）、DNA檢測(cè)（用于后續(xù)的生物分布檢測(cè)，如ddPCR檢測(cè)載體基因組）及臨床生化檢驗(yàn)（監(jiān)測(cè)血常規(guī)、生化指標(biāo)等，評(píng)估潛在毒性或副作用，如CRS相關(guān)指標(biāo)CRP、IL-6、鐵蛋白、肝酶ALT/AST等），以評(píng)估體內(nèi)CAR T細(xì)胞的生成、功能、B細(xì)胞清除效果以及安全性。對(duì)出現(xiàn)CRS/ICANS跡象的動(dòng)物，按方案使用了托珠單抗、阿那白滯素、地西泮進(jìn)行治療，其中一只動(dòng)物還使用了地塞米松。
3.7 MDF sequence：