細(xì)胞自噬的機(jī)制、類型及標(biāo)志物L(fēng)C3檢測要點(diǎn)和結(jié)果分析
在外界壓力、饑餓、缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等特殊情況下，細(xì)胞受自噬相關(guān)基因的調(diào)控，利用溶酶體降解、選擇性地清除自身受損、衰老或過剩的生物大分子和細(xì)胞器，釋放出游離小分子供細(xì)胞回收利用的正常動態(tài)生命過程。
自噬被認(rèn)為是機(jī)體的一種自我生存機(jī)制，它在細(xì)胞和組織動態(tài)平衡中起到關(guān)鍵作用。
自噬機(jī)制的受損會誘發(fā)一系列疾病包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝相關(guān)疾病、免疫性疾病、微生物感染等。
2016 年日本細(xì)胞生物學(xué)家大隅良典因“在細(xì)胞自噬機(jī)制方面的發(fā)現(xiàn)”獲得諾貝爾獎。他的研究開啟了理解自噬作用在許多勝利過程中關(guān)鍵作用的嶄新道路。
建立自噬模型，研究自噬的發(fā)生機(jī)制、自噬與疾病的關(guān)系近年來一直是熱門研究方向。
分類
根據(jù)包裹物質(zhì)及運(yùn)送方式的不同可將自噬分為三類：巨自噬(Macroautophagy),微自噬(Microautophagy)和介導(dǎo)自噬(Chaperone-mediated autophagy），通常說的自噬泛指巨自噬。
過程
自噬的本質(zhì)其實是細(xì)胞內(nèi)的膜重排，一個完整的自噬過程包括自噬啟動、自噬體形成、自噬溶酶體形成，降解及再利用。
圖2 自噬過程示意圖
細(xì)胞自噬重要基因和自噬中的信號通路相關(guān)信息可查看《細(xì)胞死亡與細(xì)胞功能》
小優(yōu)細(xì)節(jié)君今天要介紹的主角是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物：微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(microtubule-associated-proteinlight-chain-3，LC3)
LC3蛋白合成后被具有蛋白內(nèi)切酶活性的Atg4在羧基端剪切，產(chǎn)生胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾、加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）偶聯(lián)，形成脂質(zhì)化形式的 LC3-II，定位于自噬體的內(nèi)外膜上。
自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，產(chǎn)生LC3-I循環(huán)利用；內(nèi)膜上的LC3-II被溶酶體酶降解，導(dǎo)致自噬溶酶體中LC3含量很低。
因而，LC3蛋白水平被用來作為自噬評價和測定的公認(rèn)指標(biāo)，當(dāng)與溶酶體抑制劑聯(lián)用時，可以量化自噬流（一定時間內(nèi)自噬過程發(fā)生的強(qiáng)度）。
總結(jié)：在自噬體形成過程中，胞漿定位的LC3-I與PE結(jié)合并插入到自噬體的雙層膜中形成LC3-II。
LC3 檢測要點(diǎn)
01 樣本表達(dá)
在哺乳動物中，存在 4 種LC3 同工型（LC3A、LC3B、 LC3B2和 LC3C），在不同的組織細(xì)胞中表達(dá)會有差異。
目前主要研究的是LC3A和LC3B，LC3A主要在大腦中表達(dá)，其他組織的表達(dá)較低。LC3B在腦、內(nèi)分泌組織等有較高的表達(dá)，在肝臟、結(jié)腸、心肌、脾臟等基本不表達(dá)。LC3B2許多組織中都有較高的表達(dá)，在骨骼肌中基本不表達(dá)。
02 特殊處理、藥物抑制
LC3-I和LC3-II存在一個生成-降解的動態(tài)過程。自噬小體有一個生成、融合、降解的過程，即“自噬流”。
所以，單時間點(diǎn)LC3-II的表達(dá)改變并不能體現(xiàn)自噬的改變，需要使用一些阻斷溶酶體降解的藥物（如氯喹、巴佛洛霉素A1等），判斷在干預(yù)手段下，細(xì)胞的自噬程度的改變。
03 結(jié)果分析
部分細(xì)胞本身LC3-I的基礎(chǔ)水平就很低， LC3-I本身就很容易降解，也更易在SDS上樣緩沖液中降解, 對反復(fù)凍融更為敏感。
目前的LC3抗體所檢測的抗原表位都位于LC3的N端，由于PE基團(tuán)結(jié)合可能導(dǎo)致N端區(qū)域的構(gòu)象變化，使得抗體對LC3-II的親和性更高，所以LC3-II條帶顯色深并不能代表該樣本處于高自噬狀態(tài)。
在半定量時，除了使用LC3-II/LC3-I的比值外，也有科學(xué)家使用LC3-II與管家蛋白（Housekeeping Protein）的比值進(jìn)行半定量。
LC3的條帶數(shù)與樣品本身有關(guān)。有的細(xì)胞系檢測到的可能就只有一條帶，即使是同一細(xì)胞系，細(xì)胞狀態(tài)不同，樣本上樣量不同，曝光時間不同等因素都會導(dǎo)致只能看到一條帶。這跟細(xì)胞的狀態(tài)，細(xì)胞的處理條件也有關(guān)系，遇到問題需要具體分析。
04 膜相關(guān)蛋白
作為脂化和膜相關(guān)蛋白，在細(xì)胞裂解后，對其進(jìn)行冰上短暫超聲，促進(jìn)蛋白的溶解，將LC3從膜上解離。
超聲方法：35-40%的功率條件下破碎3次，每次超聲10秒，每次間隔10秒。如沒有超聲儀，可用1ml注射器針頭，冰上反復(fù)抽打裂解液10次左右，達(dá)到類似于超聲的效果。
05 小分子蛋白
LC3-I的分子量約16KD，由于LC3-II接合了PE基團(tuán)，理論上LC3-II的分子量比LC3-I更高。但是，由于帶負(fù)電的PE改變了LC-II的性質(zhì)，使其疏水性更強(qiáng)，導(dǎo)致其在電泳中遷移率更高，所以在SDS-PAGE中LC3-II顯得分子量比LC3-I小。
LC3-I與LC3-II僅有2KD差異，在WB中需注意：建議使用高濃度分離膠（如15%）進(jìn)行分離；轉(zhuǎn)膜時，使用小孔徑0.22um轉(zhuǎn)印膜，濕轉(zhuǎn)70V 1.5h，可用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果。
部分推薦產(chǎn)品：
|
貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
|
LC3A (D50G8) XP® Rabbit mAb |
|
|
LC3A (E5C9B) Rabbit mAb |
|
|
LC3B Antibody |
|
|
LC3B (D11) XP® Rabbit mAb |
|
|
LC3B (E5Q2K) Mouse mAb |
|
|
LC3A/B Antibody |
|
|
LC3A/B (D3U4C) XP ® Rabbit mAb |
|
|
LC3C (D1R8V) Rabbit mAb |
|
|
Autophagy Antibody Sampler Kit |
|
|
Bafilomycin A1 |
|
|
Wortmannin |
|
|
Rapamycin |
|
|
3-MA |
|
|
Autophagy agonist and inhibitor kit |
參考文獻(xiàn)：
Parzych KR, Klionsky DJ. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxid Redox Signal. 2014 Jan 20;20(3):460-73. doi: 10.1089/ars.2013.5371. Epub 2013 Aug 2. PMID: 23725295; PMCID: PMC3894687.
Li X, He S, Ma B. Autophagy and autophagy-related proteins in cancer. Mol Cancer. 2020 Jan 22;19(1):12. doi: 10.1186/s12943-020-1138-4. PMID: 31969156; PMCID: PMC6975070.
Yoshii SR, Mizushima N. Monitoring and Measuring Autophagy. Int J Mol Sci. 2017 Aug 28;18(9):1865. doi: 10.3390/ijms18091865. PMID: 28846632; PMCID: PMC5618514.
Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. J Pathol. 2010 May;221(1):3-12. doi: 10.1002/path.2697. PMID: 20225336; PMCID: PMC2990190.
Levine B, Kroemer G. Biological Functions of Autophagy Genes: A Disease Perspective. Cell. 2019 Jan 10;176(1-2):11-42. doi: 10.1016/j.cell.2018.09.048. PMID: 30633901; PMCID: PMC6347410.
https://www.univ-bio.com/study-center/solution/PCD.html
- 組織/細(xì)胞裂解液的原理、分類、應(yīng)用與實驗指南
- 線粒體膜電位檢測試劑盒的技術(shù)原理、實驗方法及應(yīng)用領(lǐng)域
- 病毒培養(yǎng)利器：混合常溫細(xì)胞貼壁培養(yǎng)重塑病毒分離效率
- BAY-3827作為靶向AMPK抑制劑在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝與增殖中的應(yīng)用
- ICAM-1介導(dǎo)低劑量IFN-γ誘導(dǎo)干性及高劑量IFN-γ誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制
- B細(xì)胞的功能、調(diào)控機(jī)制及人B細(xì)胞極化細(xì)胞因子套裝的技術(shù)原理與應(yīng)用
- 巨噬細(xì)胞極化套裝在腫瘤微環(huán)境中的作用及研究應(yīng)用
- 小鼠正常肺類器官細(xì)胞因子套裝在肺類器官研究中的應(yīng)用
