MS2 標(biāo)簽化 RNA 免疫沉淀在研究 RNA - 蛋白質(zhì)互作中的應(yīng)用

MS2-RIP（MS2-tagged RNA Immunoprecipitation，MS2 標(biāo)簽化 RNA 免疫沉淀）技術(shù)是一種基于RNA 標(biāo)簽和免疫沉淀的分子生物學(xué)方法，核心用于特異性捕獲與目標(biāo) RNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)（或 RNA、其他生物大分子），從而解析 RNA 在體內(nèi)的功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。它通過(guò)給目標(biāo) RNA 加裝 “分子標(biāo)簽”（MS2 莖環(huán)結(jié)構(gòu)），實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo) RNA - 蛋白質(zhì)復(fù)合物的精準(zhǔn)富集，克服了傳統(tǒng) RIP 技術(shù)中 “RNA 探針特異性低、背景干擾高” 的局限，是當(dāng)前研究 RNA - 蛋白質(zhì)互作（RNP，Ribonucleoprotein Complex）的主流技術(shù)之一。

下面通過(guò)一篇高分案例了解其具體應(yīng)用：
文章名稱：A Long Noncoding RNA Activated by TGF-β Promotes the Invasion-Metastasis Cascade in Hepatocellular Carcinoma.
發(fā)表期刊：Cancer Cell (IF 44.5)
研究思路：有研究表明TGF-β誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在癌細(xì)胞傳播中發(fā)揮重要功能，miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429）通過(guò)靶向ZEB1和ZEB2來(lái)抑制EMT和腫瘤侵襲。在本研究中作者發(fā)現(xiàn)TGF-β激活的lncRNA-ATB在肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中表達(dá)上調(diào)，并與預(yù)后不良相關(guān)。然后作者利用MS2-RIP，雙螢光素酶等技術(shù)證明lncRNA-ATB通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-200家族，上調(diào)ZEB1和ZEB2，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT和侵襲。表明lncRNA-ATB作為TGF-β信號(hào)的中介，可能是癌癥抗轉(zhuǎn)移治療的潛在靶點(diǎn)。
結(jié)果解讀：
1. 作者使用MS2-RIP技術(shù)在內(nèi)源性水平上驗(yàn)證miR-200家族與lncRNA ATB之間是否直接結(jié)合。將MS2-BS構(gòu)建至lncRNA ATB末端，并構(gòu)建MS2-GFP融合蛋白，通過(guò)GFP標(biāo)簽進(jìn)行免疫沉淀。發(fā)現(xiàn)與空載體（MS2）、miR-200s靶向位點(diǎn)突變的lncRNA-ATB（lncRNA-ATB-mut）和無(wú)miR-200s靶向位點(diǎn)的lncRNA（lncRNA- 508851）相比，lncRNA-ATB能顯著富集miR-200家族（圖H），表明miR-200家族與lncRNA-ATB存在互作。
2. 通過(guò)體外合成生物素標(biāo)記的lncRNA-ATB對(duì)內(nèi)源性miR-200家族進(jìn)行親和力下拉，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-200家族與lncRNA-ATB之間的特異性結(jié)合（圖I）。
3. 作者使用熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-200家族會(huì)降低pmirGLO-ATB報(bào)告載體的熒光素酶活性，但不會(huì)降低空載體或pmirGLO-ATB突變報(bào)告載體的熒光素酶活性（圖J），表明miR-200家族能與lncRNA-ATB結(jié)合。