場景恐懼系統(tǒng)助力APP片段通過雙重機制調控NMDA受體功能研究
論文上線截圖
這篇發(fā)表于《Neuron》的研究揭示了一種由淀粉樣前體蛋白(APP)剪切產(chǎn)生的新型內源性肽AETA，作為NMDA受體(NMDAR)的獨特調節(jié)因子。AETA通過競爭性結合NMDAR的共激動劑（甘氨酸/D-絲氨酸）位點，抑制其離子通道活性，減少鈣流入，從而抑制經(jīng)典的離子型信號傳導；同時，AETA誘導NMDAR構象變化，增強非離子型信號通路，促進突觸長時程抑制(LTD)和樹突棘收縮。體內神經(jīng)元活動增強時，AETA水平上升；而基因敲除AETA則導致NMDAR信號異常、LTD缺失及情境恐懼記憶受損，且這些缺陷可被外源性AETA補救。該研究首次揭示了AETA依賴的NMDAR激活機制，強調了AETA作為雙向調控NMDAR離子型與非離子型信號的內源性神經(jīng)調節(jié)分子的關鍵作用，為理解腦信息處理及相關神經(jīng)疾病提供了新視角。
1. AETA通過競爭性結合NMDARs共激動劑位點發(fā)揮特異性抑制作用
作者首先通過多尺度實驗體系揭示了AETA對NMDA受體的特異性調控機制。圖1A表示描述了h-分泌酶依賴的APP加工過程。在表達重組NMDARs的卵母細胞中（圖1B），100 nM AETA顯著抑制受體電流，而對照肽無此效應；劑量效應實驗顯示（圖1G-H），AETA的抑制作用不受谷氨酸濃度影響，但隨甘氨酸濃度升高而減弱，表明其競爭性結合于共激動劑位點。在年輕成年小鼠海馬腦片中（圖1C），10 nM AETA使CA3-CA1突觸的天然NMDAR電流降至基線水平的65%。通過雙光子鈣成像證實（圖1D-F），AETA選擇性地減弱NMDAR依賴的樹突棘鈣內流。作用機制研究表明，AETA的抑制效應不受谷氨酸濃度影響（圖1G），但隨甘氨酸/D-絲氨酸濃度升高而減弱（圖1H）。進一步機制研究表明（圖1I-J），AETA使甘氨酸劑量效應曲線右移，且D-絲氨酸可濃度依賴性地阻斷其抑制作用。持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)（圖1K），AETA的抑制作用在移除后仍持續(xù)20分鐘以上，且高濃度D-絲氨酸不能逆轉該效應。這些結果共同證明，AETA通過高親和力競爭性結合NMDARs共激動劑位點，持久抑制其離子型信號傳導功能。
圖1.AETA抑制NMDA受體離子遷移活性
2. AETA能夠調控NMDAR的構象變化，進而通過非離子通道依賴的機制增強長時程抑制（LTD），同時引發(fā)樹突棘的萎縮性改變
接下來，作者通過FRET-FLIM技術證明，AETA（而非對照肽CtrlP）能誘導GluN1 C端結構域發(fā)生構象重排，使熒光標記的胞內域空間距離縮短，且該作用不依賴NMDAR離子通道活性（圖2A-C）。圖2D-2G顯示，AETA可增強海馬CA3-CA1突觸的LTD幅度，即使在MK801阻斷離子流的條件下仍能促進非離子型NMDAR介導的LTD（圖2F-G）。圖2H-2J進一步證實，AETA將高頻谷氨酸刺激（HFU）誘導的樹突棘生長逆轉為萎縮（圖2I-J）。以上結果表明，AETA通過改變NMDAR構象促進其非離子型信號通路，從而增強LTD并誘導樹突棘萎縮。
圖2.AETA通過改變NMDAR構象、增強其非離子型活性來促進LTD，并誘導樹突棘萎縮
3. 體內BACE1抑制可增加內源性AETA水平從而增強LTD，且內源性AETA的生成具有神經(jīng)元活動依賴性
通過口服BACE1抑制劑LY2811376（圖3A）使內源性AETA水平提升2倍（圖3B、3C），并觀察到AETA水平升高與LTD增強相關（圖3D、3E）；進一步利用化學遺傳學（hM3Dq/hM4Di）調控前額葉皮層神經(jīng)元活性（圖3F）發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元激活可使AETA水平顯著增加4倍（圖3G），而抑制活動則無影響（圖3H）。綜上，內源性AETA水平受BACE1抑制和神經(jīng)元活性正向調控，其升高可重現(xiàn)外源性AETA對NMDAR活性和突觸可塑性的調控作用。
圖3.通過體內BACE1抑制實現(xiàn)的內源性AETA增加可增強LTD，且內源性AETA的生成隨體內神經(jīng)元活動增強而增加
4. APP/PS1模型小鼠存在谷氨酸受體信號傳導異常、長時程抑制能力喪失以及認知功能下降
通過構建APPdelETA小鼠模型（圖4A），證實AETA缺失導致突變體APP分子量減�。▓D4B）并完全喪失AETA及其前體肽CTF-h（圖4B-D）。電生理記錄顯示，AETA缺失小鼠CA1神經(jīng)元NMDAR sEPSCs頻率異常增高（圖4E-F），外源性AETA可逆轉此現(xiàn)象。沉默突觸比例增加（圖4G），且海馬LTD誘導能力缺失（圖4H-I），而記憶測試中凍結行為減少（圖4J-L）——這些缺陷均可被AETA重新表達所挽救（圖4F、4I、4L）。這些數(shù)據(jù)表明AETA是維持NMDAR正常突觸活動、LTD及記憶功能的核心調控因子。
圖4.APP/PS1小鼠表現(xiàn)出NMDAR傳遞功能改變、LTD缺失及記憶力減退
結論
結果發(fā)現(xiàn)：淀粉樣前體蛋白（APP）剪切產(chǎn)生的肽段AETA作為新型內源性調節(jié)因子，通過雙重機制調控NMDA受體功能：一方面競爭性抑制共激動劑結合位點，減少鈣離子內流以抑制經(jīng)典離子通道信號；另一方面誘導受體構象變化，特異性激活依賴p38激酶的非離子通道信號，促進長時程抑制（LTD）和突觸棘重塑。研究通過多尺度實驗證實，AETA對含GluN2A亞基的NMDAR具有選擇性調控作用，其生理水平動態(tài)響應神經(jīng)活動，基因敲除會導致突觸可塑性與記憶功能障礙。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了NMDAR非離子通道信號的內源性調控機制，為理解突觸可塑性提供了新范式，也為阿爾茨海默病等神經(jīng)精神疾病的治療靶點開發(fā)提供了理論依據(jù)。
SA218 場景恐懼系統(tǒng)
場景恐懼實驗系統(tǒng)（FCS）用于小型嚙齒類動物（大、小鼠）環(huán)境相關條件性恐懼實驗研究。嚙齒類動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的不動狀態(tài)（immobility），動物在這種情況下傾向于保持靜止不動的防御姿勢�？挂钟羲幒涂怪袠信d奮藥可以明顯縮短不動狀態(tài)持續(xù)的時間。
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