InstiGRO CHO表達(dá)體系促進(jìn)單克隆成活及增殖

01. 前 言
中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株因其快速生長以及優(yōu)秀的外源蛋白表達(dá)能力而常被選擇作為治療型蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞株。然而，細(xì)胞培養(yǎng)在諸多環(huán)節(jié)仍存在瓶頸，例如轉(zhuǎn)染后恢復(fù)、單細(xì)胞分離后分裂、靜態(tài)轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)等階段，細(xì)胞都會受到不同程度的壓力影響。尤其是在單細(xì)胞分離后細(xì)胞的代謝需求得不到滿足，會極大的影響克隆增殖，直接影響項(xiàng)目進(jìn)程。

在這里，我們展示了來自安達(dá)望（Advanced Instruments）的促單細(xì)胞生長因子 InstiGRO CHO 及其增強(qiáng)版 InstiGRO CHO PLUS 解決因克隆擴(kuò)增效果不佳而導(dǎo)致的細(xì)胞株開發(fā)低效問題的有效解決方案。InstiGRO CHO 及其增強(qiáng)版 InstiGRO CHO PLUS 使用無動物成分配方，旨在促進(jìn)單細(xì)胞形成健康的克隆團(tuán)，加速工藝流程。此外，安達(dá)望對 InstiGRO CHO PLUS 產(chǎn)品配方進(jìn)一步優(yōu)化，使得單克隆恢復(fù)率及克隆團(tuán)生長速度方面有了進(jìn)一步的提升，并且對某些表達(dá)特殊蛋白生長困難的克隆有顯著效果。

本文展示了康日百奧 CLD 團(tuán)隊(duì)使用 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 優(yōu)化已有平臺工藝的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)使用表達(dá)一種特定蛋白的 CHO-K1 細(xì)胞株，使用 VIPS^® 進(jìn)行單細(xì)胞鋪板及 Cell Metric^® 進(jìn)行單克隆成像，分別使用原工藝培養(yǎng)體系 CM A 以及 InstiGRO CHO+CM B、InstiGRO CHO PLUS+CM B 三個條件進(jìn)行單克隆培養(yǎng)。通過平均克隆匯合度和平均克隆恢復(fù)率來判斷最優(yōu)培養(yǎng)體系。我們發(fā)現(xiàn)使用 InstiGRO CHO 以及 InstiGRO CHO PLUS 時，克隆恢復(fù)率相對原工藝提高近 2 倍。使用 InstiGRO CHO 的平均克隆匯合度相對原工藝提高約 2 倍，而使用 InstiGRO CHO PLUS 的平均克隆匯合度相對原工藝提高約 8 倍。該結(jié)果證明，InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 能夠促進(jìn)分離后的單細(xì)胞成活，增加單克隆恢復(fù)率，獲得更多陽性克隆。同時，它們還能促進(jìn)克隆生長速度，縮短培養(yǎng)周期，加速工藝流程。

02. 材料與方法
我們選取表達(dá)一種特定蛋白的細(xì)胞株 CHO-K1，使用 VIPS 進(jìn)行單細(xì)胞鋪板，將待鋪細(xì)胞密度稀釋到 8000-10000 cells/mL 進(jìn)行單克隆鋪板，以保證鋪板效率。分別使用原有培養(yǎng)體系 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養(yǎng)條件，每個條件鋪 1 塊 96 孔板（康寧 3599）。

在鋪板后，培養(yǎng)板在 37°C 和 8% CO₂ 的條件下孵育 16 天。使用 Cell Metric^® 對培養(yǎng)板進(jìn)行整板成像（從第 0 天到第 16 天）。在第 7、14 天，利用 Cell Metric 軟件進(jìn)行匯合度分析。評估了第 7 天和第 14 天的克隆匯合度百分比，以及克隆恢復(fù)率。

03. 結(jié) 果
InsitGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 提高克隆恢復(fù)率并促進(jìn)克隆增殖。
鋪板后分別對 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養(yǎng)條件進(jìn)行克隆生長追蹤成像，第 16 天，統(tǒng)計(jì)形成明顯克隆團(tuán)的單克隆孔數(shù)量，計(jì)算單克隆成活率（單克隆成活率（%）=成活單克隆孔數(shù)量/鋪入單克隆孔數(shù)量*100），如圖 1 所示，A-C 分別為 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個條件第 0 天鋪板結(jié)果示意圖，其中綠色孔為鋪入單細(xì)胞的孔，灰色孔為無細(xì)胞孔，紅色孔為鋪入多細(xì)胞的孔，平均鋪板率為 74%。D-F 為三個條件在第 16 天的整孔圖像，圖像顯示，添加 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 的單克隆生長相較于未添加 InstiGRO CHO 的單克隆生長更快，形成的克隆團(tuán)更大；而添加 InstiGRO CHO PLUS 的單克隆生長相較于添加 InstiGRO CHO 的單克隆生長更快，形成的克隆團(tuán)更大。

圖 1：A-C 分別為 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS+CM B 三個培養(yǎng)條件 VIPS 單細(xì)胞鋪板結(jié)果，紅色代表鋪入的多個細(xì)胞的孔，綠色代表鋪入單細(xì)胞的孔，灰色代表無細(xì)胞孔。

D-F 分別為 CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS+CM B 三個培養(yǎng)條件第 16 天整孔成像結(jié)果，紅色叉號代表不計(jì)入統(tǒng)計(jì)的孔，綠色圓圈代表計(jì)入統(tǒng)計(jì)的單克隆來源的孔。

使用 Cell Metric 軟件匯合度算法，對克隆團(tuán)匯合度自動計(jì)算，如圖 2 顯示，CM A，InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個條件在第 7 天匯合分別為 4.14%、3.96% 以及 4.42%，無顯著差別。克隆生長到第 16 天時，匯合度分別為 7.91%、16.74% 以及 61.96%，即添加 InstiGRO 試劑能夠顯著增加克隆團(tuán)生長，且 InstiGRO CHO PLUS 相對于 InstiGRO CHO 效果更加明顯。

圖 2：CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養(yǎng)條件下第 7 天及第 16 天單克隆匯合度數(shù)據(jù)。藍(lán)色的代表第 7 天，橘色代表第 16 天。

此外，添加 InstiGRO CHO 及 InstiGRO CHO PLUS 的條件相較于未添加 InstiGRO CHO 的條件，單克隆數(shù)量更多，即克隆恢復(fù)率更高，如圖 3，原工藝下單克隆恢復(fù)率為 18.29%，添加 InstiGRO CHO 的條件單克隆恢復(fù)率為 31.42%，添加 InstiGRO CHO PLUS 的單克隆恢復(fù)率為 29.79%。

圖 3：CM A、InstiGRO CHO+CM B 以及 InstiGRO CHO PLUS +CM B 三個培養(yǎng)條件下第 16 天單克隆恢復(fù)率。

04. 結(jié)論與討論
在單克隆建系中，由于分離后單細(xì)胞獨(dú)自生長缺少共生長分泌因子，單克隆恢復(fù)率低是個普遍問題。InstiGRO CHO 以及 InstiGRO CHO PLUS 能夠促進(jìn)單細(xì)胞成活，并加快單細(xì)胞生長。同時，它們可以幫助科學(xué)家們挑出更多的候選陽性克隆，并且能提早對克隆進(jìn)行擴(kuò)增，加速整體工作流程。

作者：
劉玉梅，劉星星；康日百奧生物科技（蘇州）有限公司
張倩倩；安達(dá)望（上海）科技有限公司