脂質(zhì)體LNP CAR-T技術(shù)的原理及邏輯解析

文章來源公眾號(hào)：生物快評(píng)        作者：bio2you

細(xì)胞膜和細(xì)胞膜融合是如何發(fā)生的？

Lipid nanoparticles，中文翻譯為“脂質(zhì)體”，也就是顆粒在納米尺度上的脂質(zhì)顆粒。為什么我們關(guān)心脂質(zhì)體呢？因?yàn)樵谂R床和科學(xué)上，我們有“操作”細(xì)胞的需求（即把核酸或者蛋白遞送進(jìn)入細(xì)胞）。

我們先以化學(xué)上的甘油三酯為例開始，喚醒一下記憶：

甘油+脂肪酸->形成甘油三酯

這個(gè)是甘油三酯，主體是綠色的甘油分子，甘油分子的三個(gè)羥基OH分別和脂肪酸形成脂質(zhì)。

如果甘油其中一個(gè)OH位置不是脂肪酸，換成一個(gè)親水的物質(zhì)呢？

比如以細(xì)胞上的磷脂酰膽堿為例說明：

《Molecular Biology of the Cell  6th Edition》

藍(lán)色的為膽堿（親水頭部），綠色為甘油骨架，黃色為磷酸基團(tuán)，長(zhǎng)長(zhǎng)的紅色為脂質(zhì)，彎曲的脂質(zhì)是因?yàn)橛蠧=C雙鍵，這種雙鍵具有一定的“剛性”，改變了脂肪酸的構(gòu)象。

細(xì)胞不是你想進(jìn)，想進(jìn)就能進(jìn)。以哺乳動(dòng)物的細(xì)胞為例，外面是一層脂質(zhì)雙分子層。如下如所示，紅色的親水的頭部（通常為一些可以結(jié)合水的基團(tuán)），尾巴是分開的脂質(zhì)，脂質(zhì)不喜歡水。因?yàn)樗麄兊奶攸c(diǎn)，所以在水環(huán)境中，我們看到了細(xì)胞膜是疏水的尾部靠在一起（不喜歡就逃避），親水的頭部朝向胞外液體環(huán)境，或者朝向胞質(zhì)水環(huán)境（喜歡就多接觸）。

https://www.britannica.com/science/cell-membrane

繼續(xù)，我們?cè)跓釀?dòng)力學(xué)角度再分析一下磷脂雙分子成形成的原因

熱力學(xué)中的熵增原理是指在孤立系統(tǒng)中，系統(tǒng)的混亂度（即熵）總是會(huì)增加或保持不變，絕不會(huì)減少（熱力學(xué)第二定律）。

https://www.wizeprep.com/textbooks/undergrad/biology/4164/sections/107355

單個(gè)磷脂分子在水相中，它需要接觸水分子，因?yàn)槭杷�端不喜歡水，它會(huì)限制水分子的移動(dòng)。如果磷脂的疏水端合并，減少接觸水，那么更多的水就可以自由移動(dòng)，自由移動(dòng)的意思就是“熵增”，即混亂度增加。所以磷脂雙分子層是自發(fā)形成的。

如果在氣相，結(jié)果是相反的。

Lipid Bilayer，In subject area: Immunology and Microbiology

自發(fā)形成的磷脂雙分子層怎么就成了細(xì)胞的結(jié)界了呢？

如果我們不在化學(xué)角度上考慮這個(gè)磷脂雙分子層，那么就不好理解Na+、K+這種離子，非常小，為什么不能直接通過細(xì)胞膜呢？因?yàn)殡x子在親水頭部向疏水的雙分子層中間轉(zhuǎn)移的過程中，就是遇到脂質(zhì)，這個(gè)脂質(zhì)就像絕緣體一樣，阻隔了K+的移動(dòng)，因?yàn)樗�是疏水的，而離子是需要形成離子鍵等，需要親水的環(huán)境。

那么又人說：“好像記得化學(xué)老師說過“相似相容””，那么脂質(zhì)體和脂質(zhì)體就是應(yīng)該自發(fā)融解在一起的？換言之，細(xì)胞膜和脂質(zhì)體就是這樣“相似相容”在一起的。

對(duì)于“聰明的答案”，我想問：如果按照這個(gè)道理，每個(gè)細(xì)胞都是脂質(zhì)雙分子層，那我們緊密的細(xì)胞都是“連成”一團(tuán)肉糜了。要記住任何脂質(zhì)體的融合都不是天然發(fā)生的，需要外在的原因，因?yàn)樵谒�環(huán)境中脂質(zhì)體融合需要克服水在其中的排斥力。

比如這里兩個(gè)脂質(zhì)體之間是填充著水分子，水分子進(jìn)行著自由移動(dòng)，如果需要融合，就需要把兩個(gè)脂質(zhì)體中間的水分子都“排開”，這個(gè)需要額外的作用力，這個(gè)過程不是自發(fā)的。

那難道這個(gè)和“相似相容”原則違背了嗎？這個(gè)并沒有，相似相容指的是在溶劑中，小分子的化學(xué)物質(zhì)，比如脂溶性維生素可以溶解在油脂中，因?yàn)榫S生素和油脂之間尺寸差異非常小，而兩個(gè)類似尺寸的脂質(zhì)體需要克服水在其中的排斥力。

我們?cè)倏纯醇?xì)胞中各種尺寸的細(xì)胞器融合，都不是無緣無故自發(fā)產(chǎn)生，都是依靠“外力”作用。

Biomolecules 2023, 13(7), 1130; https://doi.org/10.3390/biom13071130

比如細(xì)胞中囊泡運(yùn)輸，需要依靠SNARE的作用，即囊泡上SNARE蛋白和靶向的膜上的t-SNAREs(target-menbrance)形成復(fù)合卷曲，這個(gè)卷曲叫做SNARE復(fù)合物，然后構(gòu)型的改變排開水分子，形成融合的膜（像個(gè)拉鏈一起）。

LNP和Lipo2000、PEI轉(zhuǎn)染試劑有何區(qū)別？

Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent和PEI試劑

Lipofectamine 2000 其成分是商業(yè)秘密，但是從原理來看是一種陽離子脂質(zhì)體混合物，其主要成分很可能包括：這些脂質(zhì)帶正電，可以與帶負(fù)電的DNA或RNA分子自發(fā)結(jié)合，形成穩(wěn)定的“脂質(zhì)-DNA/RNA復(fù)合物”（也稱為“脂質(zhì)納米顆粒”的早期形式）。這能保護(hù)核酸不被降解，并幫助其穿過細(xì)胞膜。

我們知道這種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞困難，大概率這些Lipofectamine 2000缺少兩個(gè)關(guān)鍵原因：第一就是他們非pH下降依賴的電離，所以導(dǎo)致了DNA難以從脂質(zhì)體中逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，第二就是他們?nèi)鄙侔邢颍◤某杀緛碚f，肯定無靶向抗體偶聯(lián)）。總結(jié)一下，Lipofectamine 2000是初代的脂質(zhì)體。

PEI 聚乙烯亞胺是歷史上繼多聚賴氨酸之后發(fā)現(xiàn)的第二種聚合物轉(zhuǎn)染試劑。PEI能將DNA縮合成帶正電荷的微粒，這些微�？梢责ず系綆в胸�(fù)電荷的細(xì)胞表面殘基，并通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，胺的質(zhì)子化導(dǎo)致反離子大量涌入以及滲透勢(shì)降低。上述變化導(dǎo)致的滲透膨脹使囊泡釋放聚合物與DNA形成的復(fù)合物（polyplex）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。復(fù)合物拆解后，DNA就能自由的融合到細(xì)胞核中。所以這類不屬于脂質(zhì)體，是非脂質(zhì)體形式的大分子聚合物。

LNP是什么？他怎么就可以和細(xì)胞融合呢？

以LNP-mRNA技術(shù)為例：脂質(zhì)體是5組分居多，可電離的陽離子脂質(zhì)體（核心），輔助脂質(zhì)，膽固醇和PEG，核酸材料（需要遞送的東西），注意這里可電離的陽離子脂質(zhì)體是主要在脂質(zhì)中包裹帶有負(fù)電的核酸物質(zhì)。

如果是這種無靶向的脂質(zhì)體，那么它注射進(jìn)入人體，就是依靠“被動(dòng)”進(jìn)入。比如LNP-mNRA疫苗就是依靠肌肉注射，然后被皮下的樹突狀細(xì)胞DC細(xì)胞或者朗格漢斯細(xì)胞攝入，樹突狀細(xì)胞依靠自己的特殊機(jī)制，天然可以“吞噬”體液循環(huán)中的顆粒狀物質(zhì)，然后呈遞給T細(xì)胞檢測(cè)，讓T細(xì)胞來判讀這個(gè)物質(zhì)是自己的還是敵人的殘骸，那么這個(gè)就是mRNA的核心機(jī)制。

DOI:10.1080/17425247.2022.2135502

如圖所示，吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的LNP顆粒進(jìn)入到endosome中，然后endosome的pH在質(zhì)子泵的作用下，泵進(jìn)入H+導(dǎo)致endosome的pH下降，然后陽離子脂質(zhì)體開始在這個(gè)低pH的環(huán)境下電離而帶電荷，導(dǎo)致脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)互相排斥而不穩(wěn)定，這樣里面的核酸物質(zhì)就會(huì)從脂質(zhì)體中釋放到endosome中了，最后可能1%~4%mRNA逃逸出endosome進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后mRNA結(jié)合上胞質(zhì)中的核糖體開始編碼蛋白質(zhì)。

脂質(zhì)體的形成

隨著新冠mRNA疫苗，讓大家看到了LNP-mRNA技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，開始有人想是否可以用LNP來靶向遞送？就是遞送到不具有吞噬攝取能力的細(xì)胞上，比如T細(xì)胞。

如果不加靶向的LNP容易富集到肝臟部位，如果你的靶標(biāo)剛好是肝臟那沒問題，如果不是，則會(huì)造成LNP的脫靶向。比如經(jīng)典的ALC0315脂質(zhì)體（BNT162b2遞送新冠疫苗的脂質(zhì)體）和D-Lin-MC3-DMA（Onpattro® ，Patisiran)，MC3 是首個(gè)獲批的 siRNA 藥物Patisiran 的 LNP 遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵脂質(zhì)成分。它負(fù)責(zé)將 siRNA 精準(zhǔn)遞送到肝細(xì)胞，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）。

LNP in vivo CAR-T是什么？？

在in vivo CAR-T的研發(fā)目標(biāo)之一就需要減少肝靶向，其次就是重靶向（retargeting）問題，比如靶向T細(xì)胞制備CAR-T。

https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1294929

解決辦法有兩個(gè)：

第一是對(duì)脂質(zhì)體的化學(xué)成分進(jìn)行改造，減少肝靶向。第二脂質(zhì)體偶聯(lián)靶向抗體，比如CD3\CD5\CD7\CD8靶向抗體，通過LNP含有靶向抗體，然后結(jié)合這個(gè)靶向抗體后，細(xì)胞通過這個(gè)CD3\CD5\CD7\CD8等受體內(nèi)吞LNP復(fù)合物。

第一個(gè)方向比如Capstan研發(fā)的Lipid 829在肝富集問題，顯著比benchmark（ALC0315 (BNT162b2)）少（Hunter TL, Bao Y, Zhang Y, et al. In vivo CAR T cell generation to treat cancer and autoimmune disease. Science. 2025;388(6753):1311-1317. doi:10.1126/science.ads8473）。

第二個(gè)方向，比如025年9月，虹信生物（MagicRNA）在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志（The New England Journal of Medicine）上全球首次公布了基于mRNA-LNP的In vivo CAR T候選藥物HN2301在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人的臨床試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，論文題為“In vivo CD19-CAR T-Cell Therapy for Refractory Systemic Lupus Erythematosus”。技術(shù)上通過液相微流控技術(shù)制備形成LNP-mRNA后，再次通過化學(xué)偶聯(lián)CD8-VHH抗體。結(jié)果上通過靜脈按照2mg/kg~4mg/kg給藥可以達(dá)到20%-60% CAR-T生成（6h后），24小時(shí)后B細(xì)胞急劇下降。

另外一個(gè)重靶向的思路是：不是直接將靶向抗體直接化學(xué)偶聯(lián)在LNP上，而是依靠一個(gè)連接用雙特異抗體，讓抗體的一端靶向LNP上的PEG分子，另一端靶向靶細(xì)胞分子（比如CD3 T）。目前菲鵬和Robert Alexander Wesselhoeft（Alex）博士共同創(chuàng)立的Mote Therapeutics（簡(jiǎn)稱MOTE）是一家新一代RNA療法公司，該公司的核心技術(shù)平臺(tái)MOBILIZ是一種模塊化、可擴(kuò)展、無需化學(xué)反應(yīng)的LNP功能化系統(tǒng)，具備高效且特異的細(xì)胞靶向遞送性能。他們的創(chuàng)新在于他們開發(fā)了一個(gè)靶向PEG的抗體，因?yàn)镻EG不是蛋白質(zhì)，而是一種大分子聚合物，類似半抗原，比較難以研發(fā)針對(duì)PEG的抗體。

LNP in vivo CAR-T在治療自勉疾病效果如何？

 我們直接看近期的1個(gè)臨床文章，看看LNP in vivo CAR-T在臨床上表現(xiàn)如何:

2025年9月，虹信生物（MagicRNA）在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志（The New England Journal of Medicine）上全球首次公布了基于mRNA-LNP的In vivo CAR T候選藥物HN2301在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)病人的臨床試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)，論文題為“In vivo CD19-CAR T-Cell Therapy for Refractory Systemic Lupus Erythematosus”。通過虹信生物工程化細(xì)胞靶向平臺(tái)（EnC-LNP）開發(fā)新型靶向CD8的脂質(zhì)納米顆粒遞送編碼CD19 CAR的mRNA（HN2301），在SLE病人中首次實(shí)現(xiàn)了CAR T細(xì)胞重編程、B細(xì)胞清除，同時(shí)觀察到了良好的安全性以及初步的臨床療效。該論文的發(fā)表宣告mRNA-LNP路徑的In vivo CAR T正式進(jìn)入臨床研究階段，并且在人體上首次獲得了臨床驗(yàn)證。

給藥前無需清淋處理，首先使用低劑量(2mg/dose)進(jìn)行了單次給藥，首次輸注HN2301前一周內(nèi)停用免疫抑制藥物，給藥后患者出現(xiàn)了一過性的發(fā)熱，并且伴隨著CAR T細(xì)胞的生成。給藥后6h監(jiān)測(cè)到外周血中CAR T達(dá)到10%，以及外周B細(xì)胞水平降低至給藥前10%。

安全性方面：CAR在非CD8+ 的T細(xì)胞上脫靶表達(dá)小于10%。所有3例中劑量患者在第一次給藥后均出現(xiàn)1級(jí)CRS，這與CRP和IL-6水平升高相關(guān)，3例患者均接受了單劑量tocilizumab治療。值得注意的是，肝酶，包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT），在觀察期間保持正常范圍。除短暫性淋巴細(xì)胞減少外，未見明顯的血液異常。此外，在治療期間或治療后未觀察到神經(jīng)毒性作用或其他嚴(yán)重不良事件。

評(píng)價(jià)：LNP-mRNA體內(nèi)生成CAR-T清除B細(xì)胞來治療自免疾病是非常有前景的：1）他解決了CAR-T費(fèi)用高問題，以后治療自免疾病可能比疫苗貴不了多少，費(fèi)用和抗體藥物類似，但是僅僅需要一針即可。2）其次安全性高，不涉及到基因編輯和慢病毒插入導(dǎo)致的遺傳物質(zhì)改變。3）最后CAR-T生成快，B細(xì)胞清除迅速，緩解癥狀快速。

最大的待觀察點(diǎn)：B細(xì)胞清除的深度是否足夠，再生的B細(xì)胞依然具有緩慢發(fā)病的可能。